Ο ρόλος της κινάσης ΜΚ2 στην ανάπτυξη φλεγμονής και καρκίνου του εντέρου

Abstract

MAPKAPK2 (MK2) is a direct downstream substrate of p38 and regulates pro-inflammatory cytokine production, while it is also involved in the regulation of the cell cycle and apoptosis, suggesting an important role in carcinogenesis. The role of MK2 in inflammation is the most extensively studied. It is mediated through the post-transcriptional control of pro-inflammatory cytokines, such as TNF and IL-6, and has been shown to play an important role in various inflammatory diseases in vivo. MK2 is also the main kinase that phosphorylates Hsp27, which mediates cytokine expression and has been further implicated in the regulation of cell proliferation, apoptosis and migration. Hsp27 is often found upregulated and phosphorylated in cancer and it has been associated with poor prognosis. MK2 has been proposed as a potential alternative target to p38 inhibition, as it could reproduce the beneficial effects of p38 inhibitors potentially sparing the accompanying side effects.The role of MK2 in cancer is not as well studied as in inflammation; in vivo data using MK2 knockout mice have shown that it plays an important role in the initiation and the early stages of chemically induced skin tumorigenesis in mice, mainly through the regulation of pro-inflammatory cytokine expression and the stabilization of the tumor suppressor protein p53. Recently, it was also shown that mice deficient in MK2 were resistant to the development of AOM/DSS-induced colitis-associated cancer, although the exact cellular and molecular mechanism underlying this phenotype remained unclear. In the present study, we have addressed the cell-specific pathophysiological role of MK2 in intestinal carcinogenesis. To investigate the cell-specific role of MK2 in intestinal carcinogenesis, we initially generated two new mouse strains, a complete and a conditional MK2 knockout mouse line, used two mouse models of intestinal carcinogenesis and performed bone-marrow transfers. We measured tumor number and size and assessed epithelial proliferation, apoptosis, inflammatory infiltration and angiogenesis in different time-points during disease progression. We also performed in vitro experiments to examine the response of primary intestinal mesenchymal cells lacking MK2 to different stimuli and co-cultures between epithelial organoids and mesenchymal cells to identify heterotypic interactions between different stroma populations. Finally, we used two chemical inhibitors of MK2 to assess the effect of pharmacological inhibition in intestinal tumorigenesis.We show that both genetic and chemical inhibition of MK2 was associated with reduced tumor growth, invasive potential and increased survival in the Apcmin/+ and colitis-associated cancer model. MK2-deficiency in Apcmin/+ led to deregulation of apoptosis and a significant reduction in epithelial proliferation and angiogenesis, without affecting inflammation in the intestine. Histopathological analysis during the course of the disease further revealed an important role of MK2 in tumor progression rather than initiation, as MK2 knockout mice developed comparable number of microadenomas during the initiation phase of the disease. Notably, bone-marrow transfers demonstrated that reduced tumorigenesis was not mediated by its well-described immunomodulatory roles in immune and inflammatory cells. Deletion of MK2 in intestinal mesenchymal cells (IMCs) led to both reduced tumor multiplicity and growth. Mechanistically, MK2 in IMCs was required for Hsp27 phosphorylation and the production of downstream tumorigenic effector molecules and for the growth and survival of co-cultured intestinal organoids, dominantly affecting epithelial proliferation, apoptosis and angiogenesis. Genetic ablation of MK2 in intestinal epithelial or endothelial cells was less effective in comparison to its complete deletion, leading to reduction of tumor size via modulation of epithelial apoptosis and angiogenesis-associated proliferation, respectively. Similar results were obtained in a model of colitis-associated carcinogenesis, indicating a mesenchymal-specific role for MK2 also in this model. Our findings demonstrate the central pathogenic role of mesenchymal-specific MK2/Hsp27 axis in tumorigenesis and highlight the value of mesenchymal MK2 inhibition in the treatment of cancer.

Η κινάση MK2 (Mitogen-activated protein kinase (MAPK)-activated protein kinase 2 αποτελεί απευθείας υπόστρωμα της κινάσης p38 και ρυθμίζει την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών, ενώ επιπλέον συμμετέχει στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, υποδηλώνοντας το πιθανά σημαντικό της ρόλο στην καρκινογένεση. Ο ρόλος της MK2 στη ρύθμιση της φλεγμονής είναι ο πλέον εκτενώς μελετημένος. Επιτυγχάνεται μέσω του μετα-μεταγραφικού ελέγχου της έκφρασης προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, όπως ο TNF και η IL-6, και έχει αποδειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο σε διάφορες φλεγμονώδεις ασθένειες in vivo. Η MK2 είναι επίσης η κύρια κινάση που φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Hsp27, η οποία μεσολαβεί στην έκφραση κυτοκινών και έχει περαιτέρω εμπλακεί στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης και της κυτταρικής μετανάστευσης. Η Hsp27 βρίσκεται συχνά υπερεκφρασμένη και φωσφορυλιωμένη στον καρκίνο και έχει συσχετιστεί με κακή πρόγνωση. Η ΜΚ2 έχει προταθεί ως ένας δυνητικός θεραπευτικός στόχος, εναλλακτικά της ρ38, καθώς θα μπορούσε να αναπαράγει τα ευεργετικά αποτελέσματα των αναστολέων της ρ38 χωρίς τις αντίστοιχες παρενέργειες.Ο ρόλος της MK2 στον καρκίνο δεν είναι τόσο καλά μελετημένος όσο στη φλεγμονή. Πειράματα σε ποντίκια, στα οποία έχει αποσιωπηθεί το γονίδιο που κωδικοποιεί την ΜΚ2 (MK2 knockout) έχουν δείξει ότι αυτή παίζει σημαντικό ρόλο στην έναρξη και στα πρώιμα στάδια της χημικώς επαγόμενης καρκινογένεσης του δέρματος, κυρίως μέσω της ρύθμισης της έκφρασης προ-φλεγμονωδών κυτοκινών και της σταθεροποίησης της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης ρ53. Πρόσφατα παρατηρήθηκε, επίσης, ότι τα ποντίκια με έλλειψη της MK2 είναι ανθεκτικά στην ανάπτυξη του καρκίνου που σχετίζεται με την κολίτιδα (μοντέλο AOM/DSS), παρόλο που ο ακριβής κυτταρικός και μοριακός μηχανισμός που διέπει αυτόν τον φαινότυπο έχει παραμείνει ασαφής.Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τον κυτταρο-ειδικό παθοφυσιολογικό ρόλο της ΜΚ2 στην ανάπτυξη της φλεγμονής και του καρκίνου του εντέρου.Για να διερευνηθεί ο κυτταροειδικός ρόλος της MK2 στην καρκινογένεση του εντέρου, δημιουργήσαμε αρχικά δύο νέα στελέχη ποντικών – ένα με πλήρη και ένα με δυνητικά κυτταρο-ειδική αποσιώπηση του γονιδίου που κωδικοποιεί την ΜΚ2 -, χρησιμοποιήσαμε δύο μοντέλα εντερικής καρκινογένεσης σε ποντίκια και πραγματοποιήσαμε πειράματα μεταμόσχευσης μυελού των οστών. Στη συνέχεια, μετρήσαμε τον αριθμό και το μέγεθος των όγκων που αναπτύχθηκαν και αξιολογήσαμε τον πολλαπλασιασμό του επιθηλίου, την απόπτωση, τη φλεγμονώδη διήθηση και την αγγειογένεση σε διαφορετικά χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου. Διεξήγαμε επίσης in vitro πειράματα πρωτογενών καλλιεργειών για να εξετάσουμε την απόκριση των εντερικών μεσεγχυματικών κυττάρων που φέρουν έλλειψη της MK2 σε διαφορετικά ερεθίσματα, καθώς και συν-καλλιέργειες μεταξύ επιθηλιακών οργανοειδών και μεσεγχυματικών κυττάρων για τον προσδιορισμό των ετεροτυπικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των δυο αυτών πληθυσμών του μικροπεριβάλλοντος του όγκου. Τέλος, χρησιμοποιήσαμε δύο χημικούς αναστολείς της ΜΚ2 για να αξιολογήσουμε την επίδραση της φαρμακολογικής αναστολής της στην ογκογένεση του εντέρου.Τόσο η γενετική όσο και η χημική αναστολή της MK2 οδήγησε σε μειωμένη ανάπτυξη του αριθμού και του μεγέθους των όγκων στο έντερο και αυξημένη επιβίωση τόσο στο μοντέλο Apcmin/+ όσο και στο μοντέλο της επαγόμενης από κολίτιδα καρκινογένεσης ΑΟΜ/DSS. Η έλλειψη της MK2 στο Apcmin/+ μοντέλο οδήγησε στην απορύθμιση της απόπτωσης και σε σημαντική μείωση του επιθηλιακού πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης, χωρίς, όμως, να επηρεάσει τη φλεγμονώδη διήθηση στο έντερο. Επιπλέον, η ιστοπαθολογική ανάλυση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου αποκάλυψε ότι η ΜΚ2 παίζει σημαντικότερο ρόλο στην εξέλιξη της καρκινογένεσης και λιγότερο στην έναρξη αυτής, καθώς οι ποντικοί με έλλειψη της MK2 ανέπτυξαν συγκρίσιμο αριθμό μικροαδενωμάτων κατά τη διάρκεια της φάσης έναρξης της νόσου. Στη συνέχεια, πειράματα μεταμόσχευσης μυελού των οστών έδειξαν ότι η μειωμένη ογκογένεση δεν οφείλεται στον ήδη γνωστό ανοσορυθμιστικό ρόλο της ΜΚ2 στα ανοσοποιητικά και φλεγμονώδη κύτταρα. Αντίθετα, η διαγραφή της στα εντερικά μεσεγχυματικά κύτταρα (ΕΜΚ) οδήγησε σε μειωμένο αριθμό και ανάπτυξη των όγκων. Μηχανιστικά, η MK2 βρέθηκε να είναι απαραίτητη για τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης Hsp27 στα ΕΜΚ και την συνεπαγόμενη παραγωγή ογκογόνων μορίων-τελεστών, καθώς και για την ανάπτυξη και επιβίωση εντερικών επιθηλιακών οργανοειδών, επηρεάζοντας με αυτό τον τρόπο τον επιθηλιακό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και την αγγειογένεση. Η γενετική διαγραφή της MK2 στα εντερικά επιθηλιακά ή ενδοθηλιακά κύτταρα ήταν λιγότερο αποτελεσματική σε σύγκριση με την πλήρη διαγραφή της, οδηγώντας μόνο στη μείωση του μεγέθους των όγκων μέσω επιδράσεων στη ρύθμιση της επιθηλιακής απόπτωσης και του σχετιζόμενου με την αγγειογένεση πολλαπλασιασμού, αντίστοιχα. Παρόμοια αποτελέσματα προέκυψαν χρησιμοποιώντας και το μοντέλο της καρκινογένεσης που σχετίζεται με κολίτιδα, υποδεικνύοντας ένα εξειδικευμένο ρόλο για την ΜΚ2 στα μεσεγχυματικά κύτταρα και σε αυτό το μοντέλο. Επομένως, τα ευρήματά μας αναδεικνύουν τον κεντρικό παθογόνο ρόλο που παίζει η MK2 στα μεσεγχυματικά κύτταρα του εντέρου κατά την καρκινογένεση και υπογραμμίζουν την αξία της αναστολής της ΜΚ2 στη θεραπεία του καρκίνου.