Μοριακή μελέτη της παθογένειας των κρανιοσκελετικών ανωμαλιών: ανάλυση των εμπλεκόμενων γονιδίων και των σηματοδοτικών μονοπατιών

Abstract

Cranioskeletal dysplasias can be divided into two major groups: skeletal dysplasias andcraniosynostosis. Craniosynostosis, the premature fusion of cranial sutures is further divided intosyndromic and non syndromic. The common craniosynostosis syndromes Muenke,Crouzon/Crouzon with acanthosis nigricans, Apert, Pfeiffer, Saethre-Chotzen and CFNS arecaused by mutations in FGFR1-3, TWIST1 and EFNB1 genes.FGF receptors 1-3 as well as the transcription factors TWIST1 and RUNX2 play veryimportant roles in controlling osteoblast proliferation and differentiation. Probably, they interactduring osteoblastogenesis and suture formation, thus belonging to the same pathway, eventhough the way they interact is not clear, due to inconsistency of experimental results.Craniosynostosis induced by FGFR2 and maybe TWIST1 mutations is the result of prematureor improper osteoblast differentiation at bone fronts in which increased cell proliferation maybeinvolved as well, following several different mechanisms.The aims of this study are:Α) Detection of underlying genetic cause in patients with cranioskeletal dysplasias, whichwill contribute in more accurate genotype-phenotype correlation as well as in proper patientmanagement.Β) Understanding the signaling pathway leading to craniosynostosis. In order to succeedthis we chose to study relative expression levels of the transcription factors RUNX2 and TWIST1,known to play important roles in the regulation of osteoblast differentiation, as well as COL1A1,as a differentiation marker, in patients with syndromic or non syndromic craniosynostosis andnormal individuals, in skin fibroblast cell cultures under growth conditions.C) Development of skin fibroblast cultures as a potential model for the study of differentialexpression of genes related to premature suture fusion. This model’s utility is worth evaluatingfor two reasons: fibroblasts are developmentally related to osteoblasts, therefore representinga particularly relevant cell type and they can be easily cultured and manipulated.For this study biological samples (blood/skin) were collected from 48 patients with cranioskeletal anomalies and from 2 normal regarding synostosis individuals (positional plagiocephaly and normal control sample), who presented in the Hellenic Craniofacial center atMITERA Hospital.Molecular analysis of selected genetic loci using sequencing, AFLP and/or MLPA revealedmutations in 14/46 craniosynostosis patients (molecular diagnosis at ~30%). In total, 9 differentmutations were found in FGFR2, FGFR3, TWIST1 and EFNB1 genes, of which 3 were novel, aheterozygous TWIST1 gene deletion and a FGFR3 polymorphism. Two of the novel mutations, themissense E125K and the frameshift L240fsX79, are within EFNB1 gene. E125K mutation, whichlies within ephrin domain of EFNB1, is expected to disrupt the interaction between the Ephreceptor and ephrin B1 ligand. L240fsX79 mutation results in a truncated, probably unstableprotein product. The third novel mutation, missense L138P which lies within highly conservedHLH domain of TWIST1, possibly results in loss of DNA binding capacity of the transcription factor.Molecular genetic testing of craniosynostosis patients is of great importance because itallows accurate genotype-phenotype correlation and can lead to molecular diagnosis, thusallowing proper patient’s management, genetic counseling and prenatal diagnosis.Study of relative expression levels of RUNX2, TWIST1 and COL1A1 genes, known to beexpressed in osteoblasts and play important role in their proliferation and differentiation, wasperformed in skin fibroblasts from patients with syndromic craniosynostosis, carrying mutationseither in FGFR2 or TWIST1 genes, from patients with non syndromic synostosis, from one patientwith positional plagiocephaly and from a normal individual. Cells were cultured under growthconditions.The differences in gene expression levels observed in our patients, although relativelysmall, reveal a differentiated expression pattern between pathogenic and normal samples, aswell as among pathogenic samples compared to each other.Even though further studies of RUNX2, TWIST1 and COL1A1 gene expression are required in skin fibroblasts, experimental results of this study point out that all of these genes are involvedin craniosynostosis signaling pathway, but in different ways, depending on the context.As opposed to the efforts in creating a simple, unifying model, applied to allcraniosynostosis cases, it seems that signaling pathways triggered either by FGFR2 and TWIST1mutations or in isolated synostosis cases are very different compared to each other. These results are the first targeted study of RUNX2, TWIST1 and COL1A1 gene expressionin skin fibroblasts from patients with syndromic or non syndromic craniosynostosis and fromindividuals without synostosis.

Οι κρανιοσκελετικές δυσπλασίες μπορούν να διακριθούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες: τις σκελετικές δυσπλασίες και τις κρανιοσυνοστεώσεις. Η κρανιοσυνοστέωση, η πρόωρη σύντηξη των κρανιακών ραφών, διαιρείται σε μη συνδρομική και συνδρομική. Τα συχνότερα σύνδρομα κρανιοσυνοστέωσης Muenke, Crouzon και Crouzon με μελανίζουσα ακάνθωση, Apert, Pfeiffer,Saethre-Chotzen και CFNS οφείλονται σε μεταλλαγές στα γονίδια FGFR1-3, TWIST1 και EFNB1.Οι υποδοχείς FGFR1-3 και οι μεταγραφικοί παράγοντες TWIST1 και RUNX2 παίζουν ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών. Πιθανόν να αλληλοεπιδρούν κατά την οστεοβλαστογένεση και τη δημιουργία των κρανιακών ραφών,δηλαδή να συμμετέχουν στο ίδιο σηματοδοτικό μονοπάτι, αν και λόγω των αμφιλεγόμενων πειραματικών δεδομένων, δεν είναι ακόμα πλήρως γνωστός ο τρόπος. Η κρανιοσυνοστέωση λόγω μεταλλαγών στον FGFR2 και ίσως στον TWIST1 οφείλεται σε πρώιμη ή προβληματική διαφοροποίηση των οστεοβλαστών στα οστεογενετικά μέτωπα, στην οποία μπορεί να εμπλέκεται και η αύξηση του πολλαπλασιασμού τους. Ενδεχομένως όμως, να προκύπτει μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι :Α) Η ανίχνευση της υποκείμενης γενετικής βάσης σε ασθενείς με κρανιοσκελετικές ανωμαλίες, η οποία θα συμβάλλει στο βέλτιστο και λεπτομερή συσχετισμό γονοτύπου-φαινοτύπου και στην καλύτερη διαχείριση των ασθενών.Β) Η κατανόηση του σηματοδοτικού μονοπατιού που οδηγεί σε κρανιοσυνοστέωση. Για το λόγο αυτό επιλέχθηκαν να διερευνηθούν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων RUNX2 και TWIST1, που είναι γνωστό ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών, καθώς και του γονιδίου COL1A1, που αποτελεί δείκτη διαφοροποίησης των οστεοβλαστών μεταξύ ασθενών με κρανιοσυνοστέωση, συνδρομικού τύπου ή μη και φυσιολογικών ατόμων σε καλλιέργειες δερματικών ινοβλαστών που καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες ανάπτυξης.Γ) Η προτυποποίηση της καλλιέργειας των δερματικών ινοβλαστών ως πιθανό μοντέλο μελέτης της διαφορικής έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την πρόωρη σύντηξη των κρανιακών ραφών, του οποίου η χρησιμότητα αξίζει να διερευνηθεί για δύο βασικούς λόγους: τον αναπτυξιακό συσχετισμό τους με τους οστεοβλάστες, αντιπροσωπεύοντας έναν σχετικό με αυτούς κυτταρικό τύπο και την ευκολία χειρισμού τους.Για την παρούσα μελέτη συλλέχθηκαν βιολογικά υλικά (αίμα/δέρμα) από 48 ασθενείς με κρανιοσκελετικές ανωμαλίες και 2 φυσιολογικά ως προς την κρανιοσυνοστέωση άτομα(πλαγιοκεφαλία εκ θέσεως και φυσιολογικό δείγμα ελέγχου) που προσήλθαν στο Ελληνικό Κρανιοπροσωπικό Κέντρο του Νοσοκομείου ΜΗΤΕΡΑ. Ο μοριακός έλεγχος που πραγματοποιήθηκε με ανάλυση αλληλουχίας, ΑFLP ή/και MLPAεπιλεγμένων γενετικών τόπων, ανέδειξε μεταλλαγές σε 14/46 ασθενείς με κρανιοσυνοστέωση(μοριακή διάγνωση σε ποσοστό περίπου 30%). Βρέθηκαν συνολικά 9 διαφορετικές μεταλλαγές στα γονίδια FGFR2, FGFR3, TWIST1 και EFNB1, εκ των οποίων οι 3 ήταν νέες, μια ετερόζυγη έλλειψη του γονιδίου TWIST1 και ένας πολυμορφισμός στον FGFR3. Δύο από τις νέε ςμεταλλαγές, η παρανοηματική E125K και η πλαισιοτροποποιητική L240fsX79, βρίσκονται στο γονίδιο EFNB1. Η μεταλλαγή E125K στην περιοχή ephrin της EFNB1 αναμένεται να παρεμποδίζει την αλληλεπίδρασή της με τους υποδοχείς της Eph. Η μεταλλαγή L240fsX79 οδηγεί στη δημιουργία μικρότερης, πιθανόν ασταθούς πρωτεΐνης. Η τρίτη νέα μεταλλαγή, η παρανοηματική L138P μέσα στην υψηλά συντηρημένη περιοχή HLH του παράγοντα TWIST1 πιθανόν να παρεμποδίζει την πρόσδεσή του στο DNA.Η σημασία του μοριακού ελέγχου ασθενών με κρανιοσυνοστέωση είναι μεγάλη γιατί επιτρέπει το βέλτιστο και λεπτομερή συσχετισμό γονοτύπου-φαινοτύπου για κάθε ένα από τα σύνδρομα και μπορεί να οδηγήσει σε μοριακή διάγνωση, επιτρέποντας τον ορθό χαρακτηρισμό του συνδρόμου, την κατάλληλη κλινική αντιμετώπιση του ασθενούς, την παροχή γενετικής συμβουλευτικής και τον προγεννητικό έλεγχο.Η μελέτη των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων RUNX2, TWIST1 και COL1A1 που είναι γνωστό ότι εκφράζονται στους οστεοβλάστες, παίζοντας σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίησή τους, πραγματοποιήθηκε σε δερματικούς ινοβλάστες από ασθενείς με συνδρομική κρανιοσυνοστέωση, που έφεραν μεταλλαγές είτε στo γονίδιοFGFR2, είτε στο TWIST1, από ασθενείς με μη συνδρομική συνοστέωση, από έναν ασθενή με πλαγιοκεφαλία εκ θέσεως και ένα φυσιολογικό άτομο, μετά από καλλιέργεια των κυττάρων σε συνθήκες ανάπτυξης. Στους ασθενείς διαπιστώθηκαν διαφορές των επιπέδων έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων, οι οποίες αν και μικρές υποδηλώνουν ένα διαφορετικό πρότυπο έκφρασης, τόσο μεταξύ παθολογικών και φυσιολογικών δειγμάτων όσο και ανάμεσα στα παθολογικά δείγματα, συγκρινόμενα μεταξύ τους. Αν και απαιτείται περαιτέρω μελέτη της έκφρασης των γονιδίων RUNX2, TWIST1 και COL1A1 στους δερματικούς ινοβλάστες, τα πειραματικά αποτελέσματα της παρούσας εργασίας δείχνουν ότι οι παράγοντες αυτοί εμπλέκονται στο σηματοδοτικό μονοπάτι της κρανιοσυνοστέωσης αλλά με διαφορετικό τρόπο,ανάλογα με την περίπτωση. Αντίθετα με τις προσπάθειες δημιουργίας ενός απλοποιημένου,ενιαίου μοντέλου το οποίο θα ισχύει σε όλες τις περιπτώσεις κρανιοσυνοστέωσης, φαίνεται ότι τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται τόσο από τις μεταλλαγές του FGFR2, τουTWIST1, αλλά και στις μη συνδρομικές περιπτώσεις είναι πολύ διαφορετικά μεταξύ τους. Τα αποτελέσματα αυτά είναι η πρώτη στοχευμένη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων RUNX2,TWIST1 και COL1A1 σε δερματικούς ινοβλάστες από ασθενείς με συνδρομική ή μη συνδρομική συνοστέωση και από άτομα χωρίς συνοστέωση.