Αλληλεπίδραση αυξητικών παραγόντων IGF-I/EGF και οιστραδιόλης στις λειτουργίες καρκινικών κυττάρων του μαστού: διερεύνηση σηματοδοτικών μονοπατιών και συμβολή μακρομορίων της εξωκυττάριας ουσίας

Abstract

Breast cancer is one of the most common types of cancer. On a global scale, it is the second most responsible cause for female death. Indicatively, in United Kingdom breast cancer represents 20% of all cancer types and is the main cause of death of women at the ages between 35-55 years old. In order to characterize different stages of this disease types the expression levels of Estrogen Receptors (ERs), Progesteron Receptors (PRs) as well as Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) are evaluated utilizing histopathological assessment. Indeed, Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I), Epidermal Growth Factor (EGF) and the hormone Estradiol (E2) have an important role in the development and biological behavior of breast cancer cells. Usually, the fist therapeutic step for breast cancer is hormone therapy. However, in hormone resistant tumor, cancer cell survival is promoted by developing alternative growth factor signaling pathways. Such a candidate signaling pathway is the IGF-I/EGF crosstalk. Moreover, particularly important for breast cancer is the interaction between the IGF-I/EGF axis and E2 signaling pathway which is a focus of study at a cellular level. The principal aims of the present PhD thesis include the investigation of IGF-I/EGF and E2 signaling pathways, breast cancer cell adhesion capability assessment and also, the identification of putative intracellular signaling mediators. In addition, the role of tumor suppression gene p53 was studied on cell adhesion and as a mediator of IGF-I receptor (IGF-IR) signaling. Finally, caffeine, a widely consumed substance, known to affect basic downstream signaling molecules of IGF-I/EGF and E2 pathways was investigated.IGF-I/EGF and E2 regulate several estrogen- responsive breast cancer biological functions, including cellular proliferation and motility. Cell growth is influenced by the cellular microenvironment, the extracellular matrix (ECM). ECM interactions are fundamental for carcinogenicity. Thus, ECM modifications and molecular interactions between the ECM molecules and cancer cells modulate cellular functions. To be more accurate, ECM components are involved in cellular functions of tumor cells, affecting metastasis and consequently, cancer development. Fibronectin, an abundant ECM component in breast cancer tissues, is a high molecular weight glycoprotein and has been characterized as a crucial biomarker of aggressiveness. In the present study, IGF-I/EGF and E2 were demonstrated to increase adhesion of MCF-7 cell line onto fibronectin. In addition, IGF-I/EGF and E2 mediated adhesion required IGF-I Rparticipation. The above factors were shown to activate intracellular cancer-related signaling molecules which affect functions like proliferation, adhesion and motility. Such signaling mediators include Extracellular signal-regulated kinases (Erk1/2) that belong to Mitogen- Activated Protein Kinase (MAPK) family and Phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3 kinase). Intracellularly, Erk1/2 inhibition prevents IGF-I/EGF/E2- dependent MCF-7 adhesion, indicating the importance of Erk1/2 as an intracellular signaling mediator of IGF-I/EGF/E2 mediated adhesion. Moreover, IGF-IR expression profile can be altered by Erk1/2 (full designation). Specifically, Erk1/2 pathway inhibition prevents both the expression and the activation of IGF-IR. Furthermore, IGF-IR mRNA and protein expression are sytongly enhanced by EGF and E2 action.In addition, data using confocal microscopy showed that incubation with IGF-I and EGF induced microfilament reorganization of the MCF-7 actin cytoskeleton. This reorganization seemed to be modified by the inhibition of Erk1/2, which is the main cell mediator of IGF-I and EGF. Focal Adhesion Kinase (FAK), which is activated through phosphorylation during adhesion onto a respective substrate, was designated to play a crucial role in this adhesion study. It is important to mention that incubation with IGF-I induced the co-localization of IGF-IR and FAK, which was visible close to the cell membranes of MCF-7 cells. The later indicated that IGF-IR may be considered as a meeting point for the IGF-/EGF- and E2- dependent cell adhesion onto fibronectin.Additionally, the possible role of the tumor suppressor gene p53 on the adhesion ability of MCF-7 breast cells was examined. Results of the present study showed that IGF-IR plays a key role in these cells’ adhesion. However, the activities of tumor suppressor genes can affect IGF-IR signaling and its role in breast cancer cells. The transcription of IGF-IR gene is negatively regulated by protein products of tumor suppressor genes, including the breast cancer 1 gene (BRCA1) and the p53 gene. Furthermore, the p53 gene loss of function has been shown to modify the expression of IGF-IR, and this mechanism did not include a direct binding on DNA. According to the present study, p53 did not modulate the expression of IGF-IR. Moreover, p53 did not affect the adhesion capacity of these cells onto fibronectin.This PhD thesis also investigated the role of caffeine in breast cancer cell functions. Coffee is a beverage daily consumed on a world scale. Data that correlate coffee consumption and danger of breast cancer occurrence are controversial. The role of coffee concerning the risk of breast cancer occurrence differs due to the heterogeneity of the disease and ER expression based breast cancer categorization. Caffeine, whose chemical identity is 1,3,7-trimethylxanthine has in this study been used in its original in order to investigate breast cancer cell functions.Previous studies have shown that treatment of breast cancer cell lines with caffeine affects cell proliferation. Caffeine was shown to exhibit anti-cancer properties, by decreasing growth of MCF-7 (ERα+) and MDA-MB231 (ERα-) cells. Moreover, it has been argued that caffeine acts as an anti-estrogen and modulates cell cycle pathways including ER/cyclin D1 and IGF-IR/pAkt. Thus, in the third part of the present thesis, cell lines with different ER status have been used. More specifically, the cell lines used were stably transfected MCF-7 cells that lack ERα expression, denominated MCF-7/SP10 (ERα-) cells and transfected with vector control MCF-7/csh cells (negative control). The results of the present study indicate that caffeine in a manner independent of ER status did not affect cell proliferation, but appeared to modulate cell adhesion though molecules that are related to IGF-I/EGF and E2 signaling pathways. To summarize, the results of the present thesis suggest that IGF-IR plays a crucial role in IGF-I/EGF and E2 signaling pathways which modulate cell adhesion, function that is closely correlated to cell motility and cancer development. Furthermore, the thesis presents data associated to the role of the tumor suppressor p53 gene on breast cancer cell behavior. Data on the effect of caffeine on breast cancer cell functions and on the modulation of molecules that participate in the IGF-I/EGF and E2 signaling pathways are also shown. The presented data, may contribute to the development of targeted therapeutic methods for the treatment of breast cancer.

Ο καρκίνος του μαστού ένας από τους πιο συχνούς καρκίνους, αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου στις γυναίκες παγκοσμίως. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι στο Ηνωμένο Βασίλειο, αντιπροσωπεύει το 20% των συνολικών περιπτώσεων καρκίνου και είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου των γυναικών ηλικίας 35-55 ετών. Η σταδιοποίηση των καρκίνων του μαστού, ιστοπαθολογικά, λαμβάνει υπ’ όψιν την παρουσία και τα επίπεδα έκφρασης των οιστρογονικών υποδοχέων (Estrogen Receptors - ERs), των υποδοχέων της προγεστερόνης (Progesterone Receptors - PRs), αλλά και των υποδοχέων του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Epidermal Growth Factor-Receptor - EGFR).Οι αυξητικοί παράγοντες Insulin-like Growth Factor-I, (IGF-I), Epidermal Growth Factor (EGF) και η ορμόνη Οιστραδιόλη- Estradiol (Ε2) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη και τη βιολογική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων του μαστού. Συχνά, η πρώτη θεραπευτική αντιμετώπιση του καρκίνου μαστού είναι η ορμονοθεραπεία. Ωστόσο, σε περιπτώσεις ανθεκτικότητας των όγκων σε αυτού του είδους τη θεραπεία, ενεργοποιούνται εναλλακτικά σηματοδοτικά μονοπάτια αυξητικών παραγόντων, που συμπεριλαμβάνουν την IGF-I/EGF σηματοδότηση και έτσι διατηρείται η επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του μαστού. Η αλληλεπίδραση των σηματοδοτικών μονοπατιών IGF-I/EGF και Ε2 είναι μεγάλης σημασίας και η διερεύνηση των δράσεων τους σε κυτταρικό επίπεδο είναι σημαντική για τον καρκίνο του μαστού. Βασικός ερευνητικός σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη της αλληλεπίδρασης των μοριακών σηματοδοτικών μονοπατιών των IGF-I/EGF και Ε2, στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων του μαστού, καθώς και η περαιτέρω διερεύνηση των τρόπων δράσης τους (ενδοκυτταρικοί διαμεσολαβητές). Επιπλέον, στους στόχους της μελέτης συμπεριλαμβάνεται η μελέτη της επίδρασης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 στην κυτταρική λειτουργία της προσκόλλησης και στην σηματοδότηση του υποδοχέα του IGF-Ι (IGF-ΙR). Τέλος, η μελέτη της επίδρασης της καφεΐνης, μιας καθημερινά χρησιμοποιούμενης ουσίας, που επηρεάζει τα βασικά σηματοδοτικά μόρια των IGF-I/EGF και E2, στις λειτουργίες των καρκινικών κυττάρων του μαστού, συμπληρώνει τη στοχοθεσία της διατριβής.Οι αυξητικοί παράγοντες IGF-I/EGF και η ορμόνη Ε2 ρυθμίζουν πολλές βιολογικές λειτουργίες των ορμονο-εξαρτώμενων καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των λειτουργιών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κινητικότητας. Η ανάπτυξη των κυττάρων βρίσκεται υπό την σχετική επίδραση του περιβάλλοντος στρώματος. Αυτή η αλληλεπίδραση των κυττάρων με το μικροπεριβάλλον τους, την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, θεωρείται κρίσιμη και καθοριστική για την καρκινογένεση. Έτσι, τυχόν αλλαγές στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία και οι αλληλεπιδράσεις των μορίων της με τα καρκινικά κύτταρα τροποποιούν κυτταρικές λειτουργίες. Συγκεκριμένα, τα συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, εμπλέκονται σε πολλές λειτουργίες των κυττάρων των όγκων, επηρεάζοντας έτσι, τη διαδικασία της μετάστασης και κατ’ επέκταση την κυτταρική εξέλιξη . Η ινονεκτίνη, συστατικό που βρίσκεται σε αφθονία στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία των καρκινικών κυττάρων του μαστού, είναι μία μεγάλου μοριακού βάρους γλυκοπρωτεΐνη, που έχει χαρακτηριστεί δείκτης επιθετικότητας για τη βιοπαθολογία του καρκίνου του μαστού. Στην παρούσα μελέτη, έχει δειχθεί ότι τόσο οι IGF-I/EGF όσο και η Ε2 ενισχύουν σημαντικά την προσκόλληση των MCF-7 καρκινικών κυττάρων του μαστού σε υπόστρωμα ινονεκτίνης. Επιπλέον, ο βασικός υποδοχέας (Receptor) του IGF-I, ο IGF-IR, είναι απαραίτητος για την επαγωγή της προσκόλλησης από τους IGF-I/EGF και Ε2. Οι εν λόγω παράγοντες φαίνεται να επάγουν ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μόρια που ρυθμίζουν λειτουργίες σχετικές με την καρκινογένεση, όπως ο πολλαπλασιασμός, η προσκόλληση και η κινητικότητα των κυττάρων. Τέτοιοι ενδοκυτταρικοί διαμεσολαβητές είναι το Extracellular signal-regulated kinases (Erk1/2) (ανήκει στη σηματοδότηση Mitogen- Activated Protein Kinase (MAPK) και το Phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3 kinase). Σε ενδοκυτταρικό επίπεδο, η αναστολή του Erk1/2 εμποδίζει την IGF-I/EGF/E2- εξαρτώμενη προσκόλληση των MCF-7 κυττάρων, καταδεικνύοντας ότι ο Erk1/2 είναι σημαντικός ενδοκυττάριος διαμεσολαβητής σήματος των παραγόντων αυτών για τη συγκεκριμένη κυτταρική λειτουργία. Ο Erk1/2 έχει δειχθεί, ακόμα, να τροποποιεί το προφίλ έκφρασης του (full designation) IGF-IR. Συγκεκριμένα, η αναστολή του Erk1/2 σηματοδοτικού μονοπατιού εμποδίζει τόσο την έκφραση, όσο και την ενεργοποίηση του IGF-IR υποδοχέα. Αξιοσημείωτη είναι η ενισχυτική δράση των EGF και E2 στην έκφραση του IGF-IR σε επίπεδο mRNA και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Επιπρόσθετα, δεδομένα συνεστιακής μικροσκοπίας, απέδειξαν ότι η χορήγηση IGF-I και EGF επάγει αναδιοργάνωση των ινιδίων ακτίνης του κυτταροσκελετού στα MCF-7 καρκινικά κύτταρα του μαστού. Η αναδιοργάνωση αυτή φαίνεται να τροποποιείται από την αναστολή του Erk1/2, που είναι ο βασικός κυτταρικός διαμεσολαβητής των IGF-I και EGF. Στη μελέτη της προσκόλλησης σημαντικό ρόλο έχει η κινάση της εστιακής προσκόλλησης Focal Adhesion Kinase (FAK), η οποία ενεργοποιείται (με φωσφορυλίωση) κατά την προσκόλληση του κυττάρου στο υπόστρωμα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το δεδομένο ότι η χορήγηση του IGF-I επάγει το συν-εντοπισμό των IGF-IR και FAK, που είναι ορατός κυρίως κοντά στις κυτταρικές μεμβράνες των MCF-7 κυττάρων. Τα δεδομένα αυτά καταδεικνύουν ότι ο IGF-IR είναι σημείο συνάντησης για την IGF-/EGF- και Ε2- εξαρτώμενη κυτταρική προσκόλληση σε υπόστρωμα ινονεκτίνης. Επιπροσθέτως, στην παρούσα διατριβή έχει διερευνηθεί ο πιθανός ρόλος του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 στην προσκολλητική ικανότητα των MCF-7 κυττάρων του μαστού. Με βάση τα δεδομένα της συγκεκριμένης μελέτης, ο IGF-IR διαδραματίζει ρόλο κλειδί στην κυτταρική προσκόλληση των εν λόγω κυττάρων. Ωστόσο, η λειτουργία των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, επηρεάζει τα σήματα του IGF-IR και τις δράσεις του σε καρκινικά κύτταρα του μαστού. Η μεταγραφή του IGF-IR γονιδίου, ρυθμίζεται αρνητικά από πρωτεϊνικά παράγωγα ογκοκατασταλτικών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων του γονίδιο του καρκίνου του μαστού-1 (BRCA1) και του ογκοκατασταλτικού p53. Επιπροσθέτως, η έλλειψη στη λειτουργία του p53 γονιδίου, έχει δειχθεί ότι τροποποιεί την έκφραση του IGF-IR. Ο μηχανισμός αυτός, ωστόσο, δεν περιλαμβάνει ευθεία πρόσδεση στο DNA, δηλαδή στις αλληλουχίες του υποκινητή του IGF-IR γονιδίου. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης η έκφραση του IGF-IR δεν αλλάζει από τον p53. Ακόμα, δοκιμές προσκόλλησης σε υπόστρωμα ινονεκτίνης έδειξαν ότι ο p53 δεν επηρεάζει τη συγκεκριμένη κυτταρική λειτουργία. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, έχει μελετηθεί ακόμα, ο ρόλος της καφεΐνης σε λειτουργίες καρκινικών κυττάρων του μαστού. Ο καφές είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο ρόφημα παγκοσμίως και καταναλώνεται καθημερινά από εκατομμύρια ανθρώπων. Σε ό,τι αφορά τη συσχέτιση της κατανάλωσης καφέ και του κινδύνου εμφάνισης καρκίνου του μαστού, τα δεδομένα ποικίλλουν. Η ετερογένεια της νόσου και η κατηγοριοποίηση των καρκινικών όγκων του μαστού σε ER+ και ER- διαφοροποιεί τις δράσεις του καφέ, αναφορικά με τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού. Πρόκειται για τη χημική ουσία 1,3,7-τριμεθυλοξανθίνη, που στο αντίστοιχο κομμάτι της διατριβής αυτής έχει χρησιμοποιηθεί, σε καθαρή μορφή, σε κύτταρα, προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος της σε βιολογικές λειτουργίες των καρκινικών κυττάρων του μαστού. H χορήγηση καφεΐνης σε καρκινικές σειρές του μαστού έδειξε ότι επηρεάζει την πολλαπλασιαστική ικανότητα των κυττάρων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα άλλων μελετών, η καφεΐνη εμφανίζει αντι-καρκινικές ιδιότητες, μειώνοντας την αύξηση των κυττάρων MCF-7 (ERα+) αλλά και των (ERα-) MDA-MB-231. Ως προς τον μηχανισμό δράσης της, οι ερευνητές υποστηρίζουν ότι η καφεΐνη δρα όπως τα αντι-οιστρογόνα και τροποποιεί τα ρυθμιστικά για τον κυτταρικό κύκλο μονοπάτια ER/cyclin D1 και IGF-IR/pAkt. Στο αντίστοιχο μέρος της διδακτορικής διατριβής αυτής, έχουν χρησιμοποιηθεί καρκινικές σειρές με διαφορετικό ER προφίλ έκφρασης. Συγκεκριμένα καρκινικές σειρές του μαστού, που έχουν προέλθει από μετασχηματισμένα MCF-7 κύτταρα (stable transfected), ελλιπή σε έκφραση ERα αποκαλούμενες ως MCF-7/csh (negative control) και MCF-7/SP10(ERα-). Με βάση τα αποτελέσματα της διατριβής, η καφεΐνη δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του μαστού, ανεξαρτήτως προφίλ έκφρασης των ERs, ενώ φαίνεται να τροποποιεί την κυτταρική λειτουργία της προσκόλλησης, μέσω μορίων που σχετίζονται με τη σηματοδότηση IGF-I/EGF και E2. Συνοψίζοντας, η συγκεκριμένη διατριβή προτείνει ότι o IGF-IR είναι σημαντικός για τις δράσεις των μοριακών σηματοδοτικών μονοπατιών των IGF-I/EGF και Ε2, στη λειτουργία της κυτταρικής προσκόλλησης, που είναι επίσης πολύ σημαντική για την εξέλιξη των όγκων και στενά συνδεδεμένη με την κινητικότητα των κυττάρων. Παρουσιάζει δεδομένα για τη σχέση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 και της βιολογικής λειτουργίας των κυττάρων. Επίσης περιέχει δεδομένα για το ρόλο της καφεΐνης τόσο στις λειτουργίες των καρκινικών κυττάρων του μαστού όσο και στα επιμέρους μόρια που λαμβάνουν μέρος στη μοριακή σηματοδότηση των IGF-I/EGF. Ενδεχομένως στο μέλλον, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής να φανούν χρήσιμα στη στοχευμένη θεραπευτική αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού.