Διερεύνηση της τοξικότητας ιοντικών υγρών με τη χρήση οργανισμών βιοενδεικτών και in vitro βιολογικών μοντέλων

Abstract

Given that the application of ionic liquids (ILs), either pure or in mixtures (IL-IL, IL-water, IL-acetone), is increasing rapidly, the present study investigates the toxic effects of the widely used imidazolium-based ILs, 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate ([bmim][BF4]) and 1-octyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate ([omim][BF4]), on a battery of aquatic organisms, as well as whether acetone could mediate ILs toxicity. In this context, the algae Dunaliella tertiolecta and Scenedesmus rubescens, crustaceans Thamnocephalus platyurus and Artemia franciscana, rotifers Brachionus calyciflorus and Brachionus plicatilis and the bivalve mollusk Mytilus galloprovincialis were exposed to different concentrations of [bmim][BF4], [omim][BF4] and/or a binary mixture of [bmim][BF4]–[omim][BF4] (1:1), with or without 0.06% v/v acetone, in order to determine the half maximal inhibitory concentration (IC50 values) or the median lethal concentration (LC50 values), in each case. Subsequently, mussels were exposed to sub- and nonlethal concentrations of each IL (with or without the presence of acetone) for investigating the IL-mediated cytotoxic (currently tested with the use of neutral red retention time/NRRT assay), oxidative (superoxide anions and lipid peroxidation enhancement) and genotoxic (with the use of Comet and MN assays) effects in different tissues (hemolymph/hemocytes and gills). In addition, the cytokinesis-block micronucleus assay (CBMN) was applied in human lymphocytes, as a sensitive assay for assessing the genotoxic and mutagenic ability of both ILs, with or without the presence of acetone. Moreover, in order to investigate the role of abiotic factors, such as salinity, to the induced toxic effects, the physiological behavior of the green algae D. tertiolecta (in terms of growth rate, carotene and chlorophyll a content) when exposed to ILs under different salinities (30 and 35‰) was also investigated. Except from the description of the toxic profile of the studied ILs, a more mechanistic approach, concerning ILs-mediated toxic mode of action, as well as the modulatory role of acetone on ILs-mediated toxic behavior was further performed, using isolated [omim][BF4]-treated mussel hemocytes, primarily incubated with the chaotropic agent guanidine hydrochloride (1mM GndHCl) and LC-MS-TOF analysis, respectively. According to the present study, [bmim][BF4] and [omim][BF4] could induce not only lethal effects on challenged species but also cytotoxic, oxidative, neurotoxic and genotoxic effects, as revealed by stress indices values, currently observed in tissues of M. galloprovincialis and in human lymphocytes. [omim][BF4] was found to be more toxic than [bmim][BF4] in all cases, while its toxicity seemed to be significantly modulated by the presence of acetone. ILs-mediated toxic mode of action seemed to rely on their ability to disrupt membrane proteins and lipid membrane bilayer integrity and function, as revealed using GndHCl pre-treated hemocytes, while the results of the LC-MS-TOF analysis showed that acetone probably alters [omim][BF4] hydrophilic/lipophilic character and viscosity, which in turn mediates its cellular interaction, membrane permeability and its concomitant adverse effects. Moreover, other factors, such as the physicochemical parameters and the composition of the environment/nutrient are also very important, as they can affect cells’ ability to respond under various conditions, especially when being under stress. In particular, salinity levels could play a key role in ILs-mediated inhibitory effects on D. tertiolecta, thus acting against algal growth rate rather than Chl a synthesis, merely due to the existence of a cross-linking with carotenoids. In conclusion, the present study indicates that the characterization of the imidazolium-based ILs as “green” should not be generalized and shows for the first time that carrier solvents, such as acetone, could be used for the development and usage/application of more environmentally safe ILs.

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η εκτίμηση του περιβαλλοντικού κινδύνου από τα ευρέως χρησιμοποιούμενα ιμιδαζολικά ιοντικά υγρά (ILs), τετραφθοροβορικό 1-βούτυλο-3-μεθυλιμιδαζόλιο (1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate /([bmim][BF4]) και τετραφθοροβορικό 1-μέθυλο-3-οκτυλιμιδαζόλιο (1-octyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate /[omim][BF4]), με την χρήση οργανισμών βιο-ενδεικτών και in vitro βιολογικών μοντέλων. Παράλληλα, καθώς η πιθανότητα χρήσης διαλυμάτων ILs-οργανικού διαλύτη σε ένα πλήθος εφαρμογών είναι αυξημένη, μελετήθηκε η επίδραση της ακετόνης στην ικανότητα των ILs να επάγουν φαινόμενα τοξικότητας. Αναλυτικότερα, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές τοξικότητας με την χρήση των φυτοπλαγκτονικών ειδών Dunaliella tertiolecta και Scenedesmus rubescens, των καρκινοειδών Thamnocephalus platyurus και Artemia franciscana, των τροχοζώων Brachionus calyciflorus και Brachionus plicatilis, του δίθυρου μαλακίου Mytilus galloprovincialis, παρουσία ή απουσία ακετόνης (0.06% v/v). Πέραν της ικανότητάς τους να προκαλούν θνησιμότητα στους εκτιθέμενους οργανισμούς, διερευνήθηκε η πιθανότητα επαγωγής κυτταροτοξικών (τεχνική Neutral Red Retention Time), νευροτοξικών (ενζυμική δραστικότητα ακετυλ-χολινεστεράσης/AChE) και γενοτοξικών (συχνότητα εμφάνισης μικροπυρήνων/MN, τεχνική ανάλυσης κομητών/MS assay) επιπτώσεων, καθώς και φαινομένων οξειδωτικής καταπόνησης (προσδιορισμός επιπέδων σουπεροξειδικών ανιόντων, προσδιορισμός επιπέδων μηλονικής διαλδεϋδης/ MDA) σε ιστούς (αιμόλεμφος/αιμοκύτταρα και βράγχια) του είδους M. galloprovincialis. Επιπλέον, μελετήθηκε η κυτταροτοξική και μεταλλαξιγόνος δράση των ILs, εφαρμόζοντας την τεχνική των μικροπυρήνων με τη χρήση της κυτταροχαλασίνης-Β (CBMN), σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων. Παράλληλα, για να μελετηθεί καλύτερα ο μηχανισμός δράσης των ILs και η αλληλεπίδρασή τους με την ακετόνη πραγματοποιήθηκε ανάλυση LC-MS-TOF, και in vitro μελέτες σε απομονωμένα αιμοκύτταρα του μυδιού M. galloprovincialis, έπειτα από επώαση τους με τον χαοτροπικό παράγοντα υδροχλωρική γουανιδίνη (1 mM). Τέλος, προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση των φυσικοχημικών παραμέτρων, όπως η αλατότητα, στην φυσιολογική απόκριση των φυτοπλαγκτονικών οργανισμών (ρυθμός αύξησης, επίπεδα χλωροφύλλης α και ολικών καροτενοειδών), πραγματοποιήθηκε έκθεση καλλιεργειών D. tertiolecta στα ILs υπό διαφορετικές αλατότητες (30 και 35‰). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, τα ILs μειώνουν σημαντικά τη βιωσιμότητα των εκτιθέμενων οργανισμών και προκαλούν σημαντικές προ-παθολογικές καταστάσεις. Ειδικότερα, το [οmim][BF4] που φέρει μεγαλύτερη αλκυλική αλυσίδα, εμφανίζει μεγαλύτερη τοξικότητα, σε σχέση με το [bmim][BF4] και το μίγμα [bmim][BF4]-[οmim][BF4], προκαλώντας σημαντικές διαταραχές στη φυσιολογία των εκτιθέμενων ατόμων/κυττάρων, πιθανό λόγω της ικανότητας του IL να αλληλεπιδρά με τα φωσφολιπίδια και τις πρωτεΐνες των κυτταρικών μεμβρανών, ενεργοποιώντας μια σειρά αλυσιδωτών αντιδράσεων στο εσωτερικό των κυττάρων. Το είδος και η έκταση των επαγόμενων φαινομένων επηρεάζεται σημαντικά από την παρουσία της ακετόνης, η οποία αναστέλλει σε σημαντικό βαθμό τις τοξικές επιπτώσεις του [omim][BF4]. Σύμφωνα με την ανάλυση LC-MS-TOF, φαίνεται πως η ακετόνη μεταβάλλει το ιξώδες και την λιποφιλικότητα των ILs και κατ’ επέκταση την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με τις βιολογικές μεμβράνες. Τέλος, η τοξικότητα των ILs φαίνεται πως εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις φυσικοχημικές παραμέτρους του περιβάλλοντος, καθώς επηρεάζουν την ικανότητα των κυττάρων να ανταπεξέρχονται σε διαφορετικές συνθήκες stress. Συγκεκριμένα, η αλατότητα φάνηκε να παίζει σημαντικό ρόλο στο ρυθμό αύξησης του μικροφύκους D. tertiolecta. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αμφισβητούν την ορθότητα του χαρακτηρισμού των ιμιδαζολικών ILs ως «Πράσινοι» διαλύτες. Παράλληλα, αναδεικνύει για πρώτη φορά το σημαντικό ρόλο της ακετόνης στη ρύθμιση του τοξικού χαρακτήρα των ILs, συμβάλλοντας με αυτό τον τρόπο στην προσπάθεια παραγωγής, ανάπτυξης και χρήσης περισσότερο περιβαλλοντικά φιλικών ILs.