Φυσιολογία της γήρανσης: ταυτοποίηση και μηχανισμός δράσης περιβαλλοντικών παραγόντων που επηρεάζουν τη γήρανση σε ανθρώπινα κύτταρα

Abstract

Aging is a physiological, non-reversible phenomenon that occurs in all organisms. Both genetic and environmental factors influence the aging process. Specifically, aging includes distinct, non-reversible changes in the anatomy, physiology and adaptability of multicellular organisms. Aging also involves different organs and tissues and finally results to progressive degeneration of cellular homeostasis that means the organismal ability to maintain the structural and functional integrity. Heavy metals like CrVI, Cdll, Pbll and Snll have many applications in industry. They also represent a group of labour pollutants, as they are involved in several physiological disorders, such as carcinogenesis and various tissue dysfunctions. However, limited knowledge exists regarding their effects on ageing. In the current work we provide evidence that workers chronically exposed to CrVI have considerably reduced serum levels of the biomarker of senescence and cell survival, Apolipoprotein J/Clusterin. Moreover, we have found that both the degree and the time of exposure to CrVI associate negatively with Apolipoprotein J/Clusterin serum levels. To further examine whether CrVI directly affects cellular senescence we treated two adult skin fibroblasts cultures as well embryonic fibroblasts with a range of CrVI concentrations that approximate the values recorded in the blood circulation of exposed workers. Cellular treatment with a CrVI concentration that approximates the highest concentration in the blood was extremely toxic and nearly all cells died immediately after the first treatment. Interestingly, continuous treatment with a 10-fold lower CrVI concentration resulted in the induction of premature senescence. More specifically, treated cells were growth arrested, acquired an irregular shape, were positive to ß-galactosidase staining, accumulated oxidized proteins, and over-expressed the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 and ApoJ/CLU. Similar treatments with three additional labour pollutants resulted in the induction of premature senescence by Cdll, but not by Snll or Pbll. In summary, our results indicate that exposure to CrVI induces alterations of senescence biomarkers both in vivo and in vitro. They also provide new valuable tools for monitoring CrVI cytotoxic effects in vivo as well as for re-evaluating the maximum permissive values of some labour pollutants, like CrVI and Cdll. Senescence and aging, as mentioned above, can be further accelerated by exposure of cells to a variety of oxidative agents that contribute among other effects to the accumulation of damaged proteins. The proteasome, a multicatalytic non-lysosomal protease, is responsible for the degradation of both normal and damaged proteins. The proteasome has impaired function during aging, while its increased expression delays senescence in human fibroblasts. Given the fundamental importance of proper proteasome function for the maintenance of cellular homeostasis, we aimed to identify natural compounds that activate the proteasome. In this study, we demonstrate that oleuropein, the major constituent of Olea europea leaf extract, enhances the proteasome activities in vitro, possibly through conformational changes of the proteasome. Moreover, continuous treatment of early passage human embryonic fibroblasts with oleuropein decreases the intracellular levels of ROS, reduces the amount of oxidized proteins and retains proteasome function during replicative senescence. Importantly, oleuropein-treated cultures exhibited a delay in the appearance of senescence morphology and their lifespan was extended by approximately 15%. Based on these findings we suggest that oleuropein enhances the secondary antioxidant activity of proteasomes. Another natural compound is ursolic acid, a major constituent of Eucalyptus camaldulensis extract that was found to activate the proteasome at the transcriptional level through Nrf2 that binds ARE sequences in the promoter of proteasomal genes. Ursolic acid was found to extend the proliferative lifespan, reduce the oxidized proteins and increase the activities of antioxidant enzymes and retain proteasome function during replicative senescence. In summary, these data demonstrate the beneficial effect of oleuropein and ursolic acid on human fibroblasts undergoing replicative senescence and provide new insights towards enhancement and activation of cellular antioxidant mechanisms by natural compounds. Apart from oleuropein and ursolic acid, various extracts derived from plants of the greek flora with reference to replicative senescence were studied. Pure substances isolated from these extracts were also studied and finally no significant effect on the process of replicative senescence was recorded. In the present study, we determined factors that induce aging (hexavalent chromium, divalent cadmium) as well as factors that delay this process (oleuropein and ursolic acid). Furthermore, these factors exhibit positive (heavy metals) or negative effect (oleuropein and ursolic acid) on the accumulation of oxidized proteins, thus suggesting a possible interaction with the antioxidant mechanisms of the cell. Finally, these extrinsic factors affect replicative senescence in different ways and they offer new valuable tools for monitoring the aging process.

Η γήρανση αποτελεί μια φυσιολογική, μη αναστρέψιμη διαδικασία που δεν κάνει διακρίσεις, εμφανίζεται σε όλους τους οργανισμούς, ξεκινώντας από τα κατώτερα ασπόνδυλα (π.χ. νηματώδεις σκώληκες) κι επηρεάζεται τόσο από γενετικούς όσο και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Ειδικότερα, η γήρανση όλων των πολυκύτταρων οργανισμών περιλαμβάνει διάφορα στάδια, τα οποία χαρακτηρίζονται από μη αντιστρεπτές μεταβολές στην ανατομία, στη φυσιολογία αλλά και στην προσαρμοστικότητα τους. Η γήρανση αφορά πολλαπλά όργανα και ιστούς και τελικά οδηγεί σε προοδευτικό και γενικευμένο εκφυλισμό της κυτταρικής ομοιοστασίας, δηλαδή της ικανότητας του οργανισμού να διατηρεί τη δομική και λειτουργική του ακεραιότητα. Τα βαρέα μέταλλα χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιομηχανία και αντιπροσωπεύουν μία σημαντική ομάδα εργασιακών ρύπων, καθώς εμπλέκονται σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως η καρκινογένεση και οι ιστικές δυσλειτουργίες. Ωστόσο, η γνώση που αφορά στη συσχέτιση της δράσης των βαρέων μετάλλων με τη γήρανση είναι περιορισμένη. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, βρέθηκε ότι εργάτες, που χρόνια εκτίθενται σε εξασθενές χρώμιο, παρουσιάζουν στον ορρό σημαντικά μειωμένα επίπεδα της απολιποπρωτεΐνης J/κλαστερίνης, που αποτελεί δείκτη της αναδιπλασιαστικής γήρανσης και της κυτταρικής επιβίωσης. Επιπλέον, βρέθηκε ότι ο βαθμός και ο χρόνος της έκθεσης στο εξασθενές χρώμιο συσχετίζονται αρνητικά με τα επίπεδα της απολιποπρωτεΐνης J/κλαστερίνης στον ορρό. Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του εξασθενούς χρωμίου στην αναδιπλασιαστική γήρανση, φυσιολογικοί ανθρώπινοι ινοβλάστες δέρματος από δύο ενήλικους δότες καθώς και εμβρυϊκοί ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν παρουσία του μετάλλου σε διάφορες συγκεντρώσεις, που προσεγγίζουν τις τιμές στο αίμα των εκτεθειμένων εργατών. Η επίδραση στα κύτταρα του εξασθενούς χρωμίου, σε συγκέντρωση που προσεγγίζει τη μέγιστη στο αίμα, ήταν εξαιρετικά τοξική και οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο. Ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός ότι συνεχής επίδραση με υποδεκαπλάσια συγκέντρωση εξασθενούς χρωμίου οδήγησε σε πρώιμα επαγόμενη γήρανση. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα παρουσίασαν αναστολή αύξησης, απέκτησαν φαινότυπο ανάλογο του γηρασμένου, ήταν θετικά σε χρώση β- γαλακτοσιδάσης, συσσώρευσαν οξειδωμένες πρωτεΐνες και υπερέκφρασαν τον αναστολέα της κυκλινοεξαρτώμενης κινάσης p21 και την απολιποπρωτεΐνη J. Παρόμοια επίδραση με δισθενές κάδμιο οδήγησε σε επαγωγή πρώιμης γήρανσης, που όμως δε βρέθηκε να ισχύει στην περίπτωση του δισθενούς κασσίτερου και του δισθενούς μολύβδου. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η έκθεση σε εξασθενές χρώμιο επάγει μεταβολές σε δείκτες της γήρανσης τόσο in vivo όσο και in vitro. Επίσης, παρέχουν χρήσιμα εργαλεία για την εκτίμηση των κυτταροτοξικών επιδράσεων του εξασθενούς χρωμίου in vivo, καθώς επίσης για την αναθεώρηση των μέγιστων επιτρεπτών ορίων σε εργασιακούς ρύπους, όπως το εξασθενές χρώμιο και το δισθενές κάδμιο. Η εμφάνιση της αναδιπλασιαστικής γήρανσης μπορεί να επαχθεί πρόωρα από έκθεση των κυττάρων σε πληθώρα οξειδωτικών παραγόντων που συμβάλλουν, μεταξύ άλλων επιδράσεών τους, στη συσσώρευση «κατεστραμμένων», μη λειτουργικών πρωτεϊνών. Το πρωτεόσωμα, μία πολυπρωτεϊνική μη-λυσοσωμική πρωτεάση, είναι υπεύθυνο για την αποικοδόμηση φυσιολογικών και παθολογικών πρωτεϊνών. Το πρωτεόσωμα παρουσιάζει μειωμένη λειτουργία κατά τη διάρκεια της γήρανσης, ενώ η αυξημένη έκφρασή του φαίνεται να καθυστερεί τη γήρανση σε ανθρώπινους ινοβλάστες. Η σωστή πρωτεοσωμική λειτουργία είναι σημαντική για τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιοστασίας και για το λόγο αυτό η ταυτοποίηση φυσικών ουσιών που ενεργοποιούν το πρωτεόσωμα αποτέλεσε βασικό στόχο της διατριβής. Έτσι, δείχθηκε ότι η ολεουροπεΐνη, το κύριο συστατικό του εκχυλίσματος των φύλλων της Olea europaea, ενισχύει τις πρωτεοσωμικές ενεργότητες in vitro, πιθανά μέσω διαμορφωτικών αλλαγών που επάγει στη δομή του πρωτεοσώματος. Επιπλέον, η συνεχής επίδραση ανθρώπινων εμβρυϊκών ινοβλαστών με ολεουροπεΐνη μειώνει τα ενδοκυτταρικά επίπεδα των ελευθέρων ριζών οξυγόνου και τις οξειδωμένες πρωτεΐνες και διατηρεί την πρωτεοσωμική λειτουργία κατά την αναδιπλασιαστική γήρανση. Είναι αξιοσημείωτο ότι κύτταρα που καλλιεργήθηκαν με ολεουροπεΐνη παρουσίασαν καθυστέρηση στην εμφάνιση του γηρασμένου φαινοτύπου και επιμήκυνση στο προσδόκιμο ζωής τους κατά 15%. Με βάση αυτά τα δεδομένα, συμπεραίνεται ότι η ολεουροπεΐνη ενισχύει το δευτερογενή αντιοξειδωτικό ρόλο του πρωτεοσώματος. Επίσης, δείχθηκε ότι το ουρσολικό οξύ, το κύριο συστατικό του εκχυλίσματος του Eucalyptus camaldulensis, ενεργοποιεί το πρωτεόσωμα σε επίπεδο μεταγραφής, μέσω του μεταγραφικού παράγοντα Nrf2, ο οποίος προσδένεται σε αλληλουχίες ARE στους υποκινητές των πρωτεοσωμικών γονιδίων. Κατά αντιστοιχία με την ολεουροπεΐνη, το ουρσολικό οξύ επιμηκύνει το προσδόκιμο ζωής των κυττάρων, μειώνει το οξειδωτικό φορτίο και αυξάνει τις ενεργότητες αντιοξειδωτικών ενζύμων και διατηρεί την πρωτεοσωμική λειτουργία κατά την αναδιπλασιαστική γήρανση. Συνοπτικά, τα παραπάνω δεδομένα καταδεικνύουν τις ευεργετικές δράσεις της ολεουροπεΐνης και του ουρσολικού οξέος σε κύτταρα κατά την αναδιπλασιαστική γήρανση και παρέχουν νέες δυνατότητες στην ενίσχυση και ενεργοποίηση κυτταρικών αντιοξειδωτικών μηχανισμών από φυσικές ουσίες. Ωστόσο, στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν, εκτός της ολεουροπεΐνης και του ουρσολικού οξέος, διάφορα εκχυλίσματα από φυτά της ελληνικής χλωρίδας και φυσικές ουσίες που απομονώθηκαν από αυτά σε σχέση με την εμφάνιση του φαινομένου της αναδιπλασιαστικής γήρανσης. Για τα εκχυλίσματα αυτά και τις καθαρές ουσίες δε βρέθηκε εμφανής επίδρασή τους στην εξέλιξη του φαινομένου της γήρανσης. Έτσι, στην παρούσα διδακτορική διατριβή προσδιορίστηκαν ουσίες που προάγουν τη διαδικασία της γήρανσης (εξασθενές χρώμιο, δισθενές κάδμιο), καθώς και ουσίες που την καθυστερούν (ολεουροπεΐνη και ουρσολικό οξύ). Οι ουσίες αυτές βρέθηκε να επηρεάζουν θετικά (βαρέα μέταλλα) ή αρνητικά (ολεουροπεΐνη και ουρσολικό οξύ) τη συσσώρευση οξειδωμένων πρωτεϊνών στα κύτταρα, υποδεικνύοντας πιθανή αλληλεπίδραση με τους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς του κυττάρου. Έτσι, εξωγενείς περιβαλλοντικοί παράγοντες βρέθηκαν να επηρεάζουν σημαντικά την αναδιπλασιαστική γήρανση, προσφέροντας μας νέες δυνατότητες για παρέμβαση στη διαδικασία της γήρανσης.