Μεταβολομική ανάλυση φυτικών εκχυλισμάτων και βιολογικών υγρών με την φασματοσκοπία NMR

Abstract

Τhis dissertation uses NMR-based metabolomics and chemometric methods for the analysis of several extracts of plant origin (olive oil mill water condensates, spearmint extracts, olive leaves) and biological fluids (culture media, rat urine and human blood plasma).A novel spectroscopic “standardless” analytical NMR methodology that does not necessitate the use of an internal quantification standard, qEretic2, was developed and validated for the quantification of olive leaf metabolites. This methodology was applied for the metabolite/phenolic profiling of olive leaves obtained from trees of two different cultivars (Picual, Koroneiki) as a function of leaf harvest time, resulting in the successful classification of leaves of different cultivar, while harvest time was found to also have an effect on the phenolic content of the leaves. The qualitative and quantitative characterization of olive oil mill water condensates and spearmint extracts by NMR spectroscopy was conducted in order to aid their use as phenolic antioxidant additives in functional foods. NMR analysis showed that plant origin and year of production have a significant effect on the type and quantity of bioactive and phenolic compounds present in these plant-derived extracts.The effect of olive oil mill water condensates and spearmint extracts as encapsulated antioxidant additives of functional foods on metabolism was studied in three separate studies (a) HepG2 cell cultures during cell growth, (b) an animal model utilizing the NMR-based urine analysis after acute administration of encapsulated extracts in high fat-fed rats, and (c) two clinical studies using healthy volunteers that adhered to a specific diet that included administration of microencapsulated extracts in functional foods (pariza, meat product containing an olive oil mill water condensate and yoghurt containing a spearmint extract).Multivariate statistical model analysis demonstrated the temporal changes in the metabolite profile of rat urine and the effect of bioactive compounds present in the two plant extracts. The analysis of the metabolite and blood plasma lipid profile of healthy volunteers demonstrated an extract type-dependant metabolic effect of the encapsulated components of the functional foods, in agreement with clinical biochemical blood markers (glucose, LDL-HDL cholesterol). The metabolic effect due to the consumption of the functional food was more pronounced in volunteers with at least two biochemical or anthropometric elements of cardio-metabolic risk.Finally, the NMR-obtained metabolite dataset was analysed using Metaboanalyst 3.0 in order to elucidate the metabolic pathways involved in the metabolite profile changes observed during the cell culture media, animal model and healthy volunteer studies. It was found that similar metabolic pathways were involved in all three cases after administration of the same plant-derived extract

H παρούσα διατριβή αφορά τη χρήση της Φασματοσκοπίας NMR σε συνδυασμό με τη μεταβολομική ανάλυση/χημειομετρία για την μελέτη διαφόρων φυτικών εκχυλισμάτων (υδατικού συμπυκνώματος ελιάς, αποστάγματος δυόσμου και φύλλων ελιάς) και βιολογικών δειγμάτων (μέσα κυτταρικής καλλιέργειας, ούρα, πλάσμα αίματος).Για τον προσδιορισμό και την ποσοτικοποίηση των μεταβολιτών στα φύλλα ελιάς με τη χρήση της φασματοσκοπίας NMR αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μια νέα «φασματοσκοπική» αναλυτική μεθοδολογία (qEretic2) στην οποία δεν απαιτείται η χρήση εσωτερικού προτύπου. Χρησιμοποιώντας αυτή την τεχνική πραγματοποιήθηκε μεταβολομική ανάλυση του φαινολικού προφίλ φύλλων ελιάς από δύο διαφορετικές ποικιλίες (Picual-Κορωνέικη) συναρτήσει του χρόνου συγκομιδής των φύλλων, και δείχθηκε ότι υπάρχει διαφοροποίηση του φαινολικού προφίλ τόσο με βάση τη ποικιλία όσο και τον χρόνο συγκομιδής.Ο ποιοτικός και ποσοτικός χαρακτηρισμός υδατικών συμπυκνωμάτων ελιάς και αποσταγμάτων δυόσμου με τη Φασματοσκοπία NMR πραγματοποιήθηκε με σκοπό την μετέπειτα χρήση τους ως φαινολικών ενισχυτικών πρόσθετων σε λειτουργικά τρόφιμα. Βρέθηκε ότι η προέλευση και το έτος παραγωγής επιδρούν σημαντικά στο φαινολικό και στο γενικότερο μεταβολικό προφίλ των εκχυλισμάτων αυτών.Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη της πιθανής μεταβολικής επίδρασης των υδατικών φαινολικών συμπυκνωμάτων και του αποστάγματος δυόσμου ως εγκαψυλιωμένων προσθέτων σε λειτουργικά τρόφιμα στο μεταβολισμό (α) καλλιέργειας ηπατοκυττάρων HepG2 κατά τη διάρκεια της κυτταρικής ανάπτυξης, (β) σε ένα μοντέλο αρουραίων που περιελάμβανε οξεία χορήγηση του φαινολικού συμπυκνώματος και δυόσμου και ανάλυση του μεταβολικού προφίλ των ούρων, και (γ) σε δύο κλινικές μελέτες ευρείας κλίμακας σε υγιείς εθελοντές που ακολούθησαν συγκεκριμένη δίαιτα που περιελάμβανε λειτουργικά τρόφιμα που περιείχαν τα φυτικά εκχυλίσματα (παριζάκι με υδατικό εκχύλισμα ελιάς/γιαούρτι με απόσταγμα δυόσμου).Με τη χρήση πολυπαραμετρικών στατιστικών μοντέλων ανάλυσης μελετήθηκε η χρονική διαφοροποίηση του μεταβολομικού προφίλ των ούρων των αρουραίων και η επίδραση που επιφέρουν οι βιοδραστικές ενώσεις που περιέχονται στα δύο εκχυλίσματα. Η ανάλυση του μεταβολικού και λιπιδαιμικού προφίλ του πλάσματος αίματος των υγειών εθελοντών έδειξε ότι εμφανίζεται μεταβολική επίδραση από το εγκαψυλιωμένο συστατικό του λειτουργικού τροφίμου, η οποία εξαρτάται από τον τύπο του φυτικού εκχυλίσματος και συμφωνεί με τις κλινικές μετρήσεις των εθελοντών, οι οποίες έδειξαν βελτιώσεις σε μια σειρά από καρδιομεταβολικούς βιοχημικούς δείκτες. Η μεταβολική διαφοροποίηση λόγω της επίδρασης της λήψης του λειτουργικού τροφίμου παρουσιάστηκε με πιο εμφανή τρόπο για εθελοντές οι οποίοι εμφάνιζαν βιοχημικά στοιχεία υψηλότερου καρδιομεταβολικού κινδύνου.Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση των μεταβολομικών δεδομένων NMR με τη χρήση της πλατφόρμας Metaboanalyst 3.0 για τον εντοπισμό των μεταβολικών μονοπατιών που πιθανώς ενεργοποιούνται με τη λήψη των φυτικών εκχυλισμάτων στην καλλιέργεια ηπατοκυττάρων, στη μελέτη των αρουραίων και στους εθελοντές της κλινικής μελέτης, η οποία έδειξε ότι τα μεταβολομικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται και στις τρεις περιπτώσεις είναι παρόμοια για το ίδιο φυτικό εκχύλισμα.