Ρύθμιση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p21 από το προ-αποπτωτικό μόριο CHOP και το στρές του ενδοπλασματικού δικτύου

Abstract

The accumulation of unfolded and misfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER) causes stress that has been designated as ER stress. Cells respond to ER stress by initiating a biochemical response that is designated as unfolded protein response (UPR) and which in its early stages or in mild ER stress is prosurvival while during prolonged or intense ER stress becomes pro-apoptotic. ER stress is involved in the pathogenesis of various diseases, including diabetes, at which the increased demands for insulin production and secretion, induces ER stress in the pancreatic beta cells. Ultimately the beta cells die of ER stress–associated apoptosis compromising pancreatic function and glucose homeostasis. The transcription factor CHOP (CCAAT/enhancer binding protein) is instrumental for induction of ER stress-related apoptosis. p21/waf1 is an established tumor suppressor, however, it also exhibits a pro-survival function as it protects from induction of apoptosis. Despite though our increased understanding of the mechanisms governing apoptosis triggered by ER stress, the transition from the pro-survival towards the pro-apoptotic mode of the unfolded protein response (UPR) remains poorly understood. Here we show that during prolonged ER stress caused by tunicamycin, an antibiotic promoting ER- stress, CHOP suppresses in vitro and in vivo the expression of p21/waf1, a cell cycle regulator with strong anti-apoptotic activity. This effect, at least in part, is the direct consequence of CHOP action on p21 promoter, as indicated by reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays. This suppression of p21 levels was independent of p53 that is the major transcriptional regulator of p21, but could be reproduced by forced expression of CHOP. Consistently with these findings, siRNA-mediated inhibition of p21 levels restored the sensitivity of CHOP-deficient cells to tunicamycin. Our findings indicate that CHOP relieves the anti-apoptotic activity of p21 during ER stress. Thus, p21 is implicated in the regulation of the UPR by inhibiting the induction of apoptosis. Accordingly, our study provides hints for understanding the role of CHOP in ER stress-mediated apoptosis since malfunction of this homeostatic mechanism has been implicated in a variety of common diseases such as diabetes. Our results predict that genetic ablation of p21 will render mice more sensitive to the disease. In order to test this hypothesis, p21-deficient mice and wild type controls were fed with HFD and high sucrose in drinking water. p21-deficient mice were more sensitive to T2D development and exhibited a delayed response in glucose homeostasis as indicated by glucose tolerance tests. Αdministration of nutlin-3a was sufficient to restore pancreatic function and to reduce the glucose levels in the wild type diabetic mice but not in p21KO mice. A second group of experimental animals became diabetic by a combination of streptozotocin (STZ) and high fat diet (HFD). Under these conditions only a fraction of the pancreatic beta cells is damaged, increasing the load for insulin production to the remaining surviving islets, ultimately causing ER stress and T2D. A cohort of these animals, after diabetes induction was confirmed, received nutlin-3a. Nutlin-3a is a small molecule inhibitor of MDM2-p53 interaction that stabilizes p53 and ultimately elevates p21 levels. Αdministration of nutlin-3a was sufficient to restore pancreatic function and to reduce the glucose levels in the diabetic mice. Our results are consistent with recent findings suggesting that nutlin-3a treatment concomitantly with STZ administration inhibits diabetes and that conditional expression of p21 in the islet cells of transgenic mice causes increased pancreatic cell regeneration and suggest that activation of p21 expression is beneficial for the management of T2D.Collectively, we identified p21 as a target of CHOP transcription factor. Interference with p21 activity during ER stress may be beneficial in conditions in which modulation of cells’ sensitivity to apoptosis is desired.

Σε καταστάσεις παρατεταμένου και έντονου ‘stress’ το ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕΔ) ενεργοποιεί ένα σύνθετο βιοχημικό μονοπάτι απόκρισης γνωστό ως UPR (Unfolded Protein Response) κατά το οποίο, το κύτταρο οδηγείται σε απόπτωση. Σε στρεσσογόνες συνθήκες του ΕΔ επάγεται ο μεταγραφικός παράγοντας chop/GADD153 ενεργοποιώντας γονίδια που σχετίζονται με την απόπτωση. Από την άλλη πλευρά, παράγοντες όπως η p21/waf1 προστατεύουν το κύτταρο αποτρέποντάς το από την απόπτωση, μέσω της καθήλωσής του στη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Ένα θεμελιώδες ερώτημα σχετικά με την απόφαση για την επιβίωση ή μη των κυττάρων, είναι ποιά σηματοδοτικά μονοπάτια του UPR διαδραματίζουν ρόλο σε αυτή τη μετάβαση αλλά και πώς ρυθμίζεται το UPR. Για το σκοπό αυτό, έχει ιδιαίτερη σημασία να καταλάβουμε ποιοί είναι οι βασικοί αισθητήρες των αποκρίσεων αυτών και πώς αυτές οι αποκρίσεις ενσωματώνoνται στο κυτταρικό μηχανισμό κάνοντας τον βραχυπρόθεσμα ή μακροπρόθεσμα, κατά το στρες του ΕΔ, προστατευτικό ή προ- αποπτωτικό της επιβίωσης των κυττάρων. Στη συγκεκριμένη διατριβή αξιολογήθηκε τόσο ο ρόλος του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p21/waf1 όσο και η πιθανή ρύθμιση του, από τον μεταγραφικό παράγοντα chop/GADD153 υπό συνθήκες στρες του ΕΔ. Η φαρμακολογική επαγωγή του στρες του ΕΔ με τουνικαμυκίνη ή με υπερέκφραση του chop/GADD153 προκαλεί καταστολή των μεταγραφικών και μεταφραστικών επιπέδων της p21. Tο chop/GADD153 επάγεται από το παρατεταμένο ‘stress’ του ΕΔ προκαλώντας μείωση των επιπέδων της p21, πρωτεΐνη απαραίτητη ώστε να οδηγηθούν τα κύτταρα σε απόπτωση. Η καταστολή της p21/waf1 φαίνεται να αποκαθιστά την ευαισθησία των κυττάρων που δεν εκφράζουν το chop στην τουνικαμυκίνη συγκριτικά με τα αγρίου τύπου κύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα, τουλάχιστον εν μέρει, αποδεικνύει ότι προκειμένου το chop να επάγει αποτλεσματικά την απόπτωση απαιτείται καταστολή της p21. Σειρά πειραμάτων με χρήση κυττάρων σε καλλιέργεια έδειξαν ότι πράγματι το chop ρυθμίζει μεταγραφικά την ενεργότητα του υποκινητή της p21 με άμεσο τρόπο καθώς έχει τη δυνατότητα να συνδέεται μαζί του ειδικά σε συνθήκες στρες του ΕΔ. Υποδεικνύεται, λοιπόν, ότι το CHOP σχετίζεται με την αντι-αποπτωτική δράση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p21/waf1 κατά τη διάρκεια ‘stress’ του ΕΔ. Το p21/waf1 εμπλέκεται στη ρύθμιση του ενδογενή αντισταθμιστικού κυτταρικού μηχανισμού (UPR) μέσω αναστολής της επαγόμενης απόπτωσης. Επομένως, η μελέτη προσθέτει δεδομένα για το ρόλο της p21 το οποίο ρυθμίζεται από το chop/GADD153 στη μετάβαση από τη επιβιωτική στην προ-αποπτωτική κατάσταση.Η διαταραχή της ισορροπίας αυτής σχετίζεται με παθολογικές καταστάσεις, όπως ο διαβήτης. Στο πλαίσιο του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (T2D), ενεργοποιείται κυτταρικός θάνατος διαμεσολαβούμενος από το μόριο CHOP, που είναι άρρηκτα συνδεδεμένος με δυσλειτουργία του παγκρέατος. Η γενετική απαλοιφή του γονιδίου p21 αυξάνει την ευαισθητοποίηση πειραματικών μοντέλων στο διαβήτη που προκαλείται από δίαιτα πλούσια σε λιπαρά, ενώ φαρμακολογική διέγερση της έκφρασης της p21 σε διαβητικά πειραματόζωα μέσω nutlin-3a, έχει ως συνέπεια την επαναφορά των αγρίου τύπου όχι των p21 knockout μυών από την υπεργλυκαιμία που προκαλείται από τον επαγόμενο διαβήτη μέσω δίαιτας πλούσια σε λιπαρά ή με στρεπτοζοτοκίνη, την αποκατάσταση της λειτουργίας του παγκρέατος αλλά και την διευκόλυνση της διατήρησης της ομοιόστασης της γλυκόζης.Τα ευρήματα αυτά αναγάγουν την p21 ως διαμορφωτή του επαγόμενου στρες του ΕΔ μέσω CHOP το οποίο σχετίζεται με τον κυτταρικό θάνατο και παράλληλα υποδηλώνουν ότι, η διέγερση της δραστικότητας της p21 μπορεί να είναι επωφελής για τη διαχείριση του σακχαρώδη διαβήτη καθώς και άλλων καταστάσεων στις οποίες το στρες του ΕΔ ενοχοποιείται για τον κυτταρικό θάνατο.