Ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αλόγων

Abstract

In the present study a general screening protocol is developed to detect prohibited substances and metabolites for doping control purposes in equine sports. It is based on the establishment of a unified sample preparation and on the combined implementation of liquid and gas chromatographic MS analysis. The sample pretreatment begins with two parallel procedures: enzymatic hydrolysis of sulfate and glucuronide conjugates, and chemical hydrolysis (methanolysis) of the 17β-sulfate steroid conjugates. The extracts are treated for LC-TOF-MS, GC-HRMS and GC-MS analyses. The majority of the prohibited substances are identified through a high mass accuracy technique, such as LC-TOF-MS, without prior derivatization. The sample preparation procedure includes the formation of methylated and trimethylsilylated derivatives common in toxicological GC-MS libraries. The screening method is enhanced by post-run library searching using automated mass spectral deconvolution and identification system (AMDIS) combined with Deconvolution Reporting Software (DRS), in order to identify banned compounds that are not targeted. The current methodology is able to detect the presence of more than three hundred and fifty target analytes in horse urine and may easily incorporate a lot of new substances without changes in chromatography. The full scan acquisition allows retrospective identification of prohibited substances in stored urine samples after reprocessing of the acquired data. Validation is performed for sixty representative compounds and includes limit of detection, matrix interference, extraction recovery, mass accuracy, matrix effect and carry over contamination. The suitability of the method was demonstrated with previously declared positive horse urine samples and with urine specimens from the proficiency test of Association of Official Racing Chemists 2012.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναπτύσσεται μια γενικευμένη μέθοδος σάρωσης για τον ποιοτικό προσδιορισμό της ταυτότητας απαγορευμένων ουσιών και μεταβολιτών αυτών, με σκοπό τον έλεγχο ντόπινγκ στα ιππικά αθλήματα. Αυτή βασίζεται στο σχεδιασμό μιας ενοποιημένης παρασκευαστικής πορείας και στη συνδυασμένη εφαρμογή υγρο- και αεριοχρωματογραφίας – φασματομετρίας μαζών για την ανάλυση των προκατεργασμένων δειγμάτων ούρων αλόγων. Η προετοιμασία των δειγμάτων αρχίζει με δύο παράλληλα στάδια: ενζυμική υδρόλυση των εστέρων του γλυκουρονικού και του θειικού οξέος, και χημική υδρόλυση (μεθανόλυση), κυρίως, για τους 17β-θειικούς εστέρες των αναβολικών στεροειδών. Τα εκχυλίσματα επεξεργάζονται, καταλλήλως, για αναλύσεις LC-TOF-MS, GC-MS και GC-HRMS. Η πλειοψηφία των εξεταζόμενων ουσιών ανιχνεύονται χωρίς παραγωγοποίηση, μέσω της τεχνικής LC-TOF-MS, η οποία εμφανίζει την ικανότητα μέτρησης ακριβούς μάζας. Η προετοιμασία των δειγμάτων περιλαμβάνει σχηματισμό μεθυλο- και TMS-παραγώγων, τα οποία είναι πολύ διαδεδομένα στις τοξικολογικές βιβλιοθήκες GC-MS. Η μέθοδος σάρωσης ενισχύεται με την αναζήτηση απαγορευμένων ουσιών σε βιβλιοθήκες φασμάτων μαζών, χρησιμοποιώντας προγράμματα φασματικής αποσυνέλιξης, AMDIS και DRS. Η εν λόγω μεθοδολογία εμφανίζει την ικανότητα ταυτοποίησης περισσότερων των τριακοσίων πενήντα απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αλόγων κι επιπλέον, μπορεί να ενσωματώσει νέες ουσίες, χωρίς αλλαγές στη χρωματογραφία. Επίσης, η ανάλυση σε λειτουργία πλήρους σάρωσης (LC-TOF-MS, GC-MS), επιτρέπει την αναδρομική εξέταση παλαιών δειγμάτων με επεξεργασία των δεδομένων που είχαν ληφθεί. Η επικύρωση πραγματοποιείται για εξήντα ουσίες και περιλαμβάνει προσδιορισμό ορίου ανίχνευσης, ανάκτησης από εκχύλιση, επίδρασης του υποστρώματος, επιμόλυνσης από προηγούμενο δείγμα, όπως επίσης, έλεγχο των παρεμποδίσεων από το υπόστρωμα και της ικανότητας μέτρησης ακριβούς μάζας. Η καταλληλότητα της μεθοδολογίας αποδείχτηκε και με την εφαρμογή αυτής σε αυθεντικά θετικά δείγματα ούρων, όπως επίσης και στα δείγματα του «Proficiency Test» του AORC του 2012.