Μελέτη σταθεροποιητικών παραγόντων για τον έλεγχο φαρμακοδιέγερσης σε ούρα

Abstract

According to the World Anti-doping Agency (WADA) Code for the collection of sport urine samples, no stabilization method is applied in the sample collection equipment system in order to prevent degradation of urine compounds. However, urine sample transport conditions are not always consistent with proper storage of samples, especially during summer months. During this period, microorganisms present in the sample rapidly increase in number and may affect sample constituents. Furthermore, the possibility of intentional contamination of sports samples during sample collection with proteolytic enzymes in order to adulterate samples by masking the abuse of prohibited substances cannot be excluded. Consequently, urine samples should be stabilized with a suitable method in a way that protects the integrity of the samples. The present study, conducted within the framework of a WADA research grant, examines the physical and chemical stabilization methods available focusing on sport urine samples. After summarizing the effects of microbial contamination and enzymatic activities on doping control urine samples, the potential sources of microorganisms in urine specimens are quoted. In addition, the previous literature on the stability of steroid conjugates and hormones is presented. Physical and chemical methods of microorganism control and enzymatic action are discussed extensively. Preliminary tests were conducted to investigate the effectiveness of selected physical stabilization methods (membrane filtration and UV radiation). After taking into account several practical and economical issues, the physical stabilization methods were considered impractical and interest was directed towards chemical methods. There are a large number of chemicals which inhibit microbial growth and proteolytic action but there is no single chemical agent possessing at the same time a wide antimicrobial and antifungal spectrum, as well as broad specificity against proteolytic enzymes. As a result, a chemical stabilization Summary 186 mixture, consisting of antimicrobial substances and various protease inhibitors, was tested in a series of incubation experiments. The experimental protocol for the stabilization of endogenous steroids focused on inoculation of pooled urine fortified with conjugated and deuterated reference steroids with seven prokaryotic (bacteria) and two eukaryotic (fungus, yeast) microorganisms in the presence and absence of the stabilization mixture. Both series of aliquots were incubated at 37 °C for 7 days or stored at -20 °C to serve as reference. The nine microbial strains, selected for the experimental protocol, are representative of species related with human microbial flora, urinary tract infections (UTI), indoor air pollution and possess the enzymes capable of altering the steroids profile under certain conditions. Evaluation of results showed that the introduction of the chemical stabilization mixture to urine samples inhibited microorganism growth and prevented steroid degradation at 37 °C. In parallel with incubation experiments, statistical analysis of the screening results from real doping control samples with signs of degradation and collected over a period of two years was carried out to investigate the influence of parameters like gender, collection date, country of origin, pH and sg values. Statistically significant differences were recorded between gender, season, country, pH values and peak heights of 5a-androstane-3,17-dione formed in contaminated samples. The experimental protocol for the stabilization of recombinant erythropoietin involved two linked series of experiments. Six proteolytic enzymes, representatives of different sub-groups of endopeptidases were selected according to their availability and their potential to be misused by athletes. In the first series of experiments, urine aliquots spiked with recombinant erythropoietin and proteases were incubated for 7 days with and without the chemical mixture at 37 °C or stored at -20 °C to serve as reference. EPO concentrations were determined with an automated chemiluminescent assay. A second experiment was performed within a shorter time period of 4 days, involving urine samples incubated at 37 °C or stored at -20 °C. EPO measurements were carried out using two analytical techniques for comparison purposes: the chemiluminescent immunoassay and the EPO test adopted by WADA based on IEF, doubleblotting and chemiluminescence detection. Evaluation of results suggested that the addition of the chemical stabilization mixture prevented EPO digestion by proteolytic enzymes, together with the storage of urine samples at -20 °C. Summary 187 For the stabilization of the intact hCG molecule, incubation experiments were conducted during a 4-day period, in the presence or absence of the stabilization mixture in urine aliquots spiked with six proteases (first series of experiments) and one microorganism, E. coli (second series of experiments). Intact hCG levels were evaluated using the commercial EIAgen Total hCG kit. Overall, the results presented in the current study demonstrated that the chemical stabilization mixture can stabilize the endogenous steroids, EPO and hCG in almost the entire range of the experimental conditions tested, which is a very promising fact for the future practical application of specially designed sample collection container, coated with the chemical stabilization mixture.

Σύμφωνα με τον Κώδικα του Παγκόσμιου Οργανισμού Αντι-Ντόπινγκ (WADA) για τη συλλογή των δειγμάτων ούρων αθλητών, καμία μέθοδος σταθεροποίησης δεν εφαρμόζεται στα δοχεία συλλογής των ούρων για την πρόληψη της αποδόμησης των συστατικών των ούρων. Εντούτοις, οι συνθήκες μεταφοράς των δειγμάτων ούρων δεν είναι πάντα σύμφωνες με τη σωστή αποθήκευση των δειγμάτων, ιδιαίτερα τους ζεστούς μήνες του χρόνου. Κατά τη διάρκεια της περιόδου αυτής, οι μικροοργανισμοί που είναι παρόντες στα δείγματα πολλαπλασιάζονται γρήγορα και ενδέχεται να επηρεάσουν τα συστατικά των ούρων. Επιπροσθέτως, δεν μπορούν να αποκλειστούν οι πιθανότητες σκόπιμης επιμόλυνσης των δειγμάτων με πρωτεολυτικά ένζυμα ώστε να συγκαλυφθεί η κατάχρηση απαγορευμένων ουσιών. Συνεπώς, η ακεραιότητα των δειγμάτων ούρων θα έπρεπε να προστατεύεται με μια κατάλληλη μέθοδο σταθεροποίησης. Η παρούσα εργασία, που εκπονήθηκε στα πλαίσια ενός ερευνητικού προγράμματος του WADA, εξετάζει τις διαθέσιμες φυσικές και χημικές μεθόδους σταθεροποίησης εστιάζοντας στα δείγματα ούρων αθλητών. Μετά τη σύνοψη των επιπτώσεων της μικροβιακής επιμόλυνσης και της ενζυμικής δράσης στα δείγματα ούρων ελέγχου ντόπινγκ, παραθέτονται οι μικροοργανισμοί και τα ένζυμα που σχετίζονται με την αλλοίωση των δειγμάτων ούρων. Επιπρόσθετα, επιχειρείται μια σύντομη βιβλιογραφική ανασκόπηση της σταθερότητας των συζευγμένων στεροειδών και ορμονών. Οι φυσικές και χημικές μέθοδοι ελέγχου της μικροβιακής αύξησης και ενζυμικής δράσης συζητιούνται εκτενώς. Αρχικά, διεξήχθησαν κάποιες προκαταρτικές δοκιμές ώστε να εξεταστεί η αποτελεσματικότητα των φυσικών μεθόδων σταθεροποίησης που επιλέχθησαν (διήθηση μέσω μεμβράνης και ακτινοβολία UV). Αφού εξετάστηκαν αρκετά πρακτικά και οικονομικά Περίληψη 183 θέματα, οι φυσικές μέθοδοι σταθεροποίησης θεωρήθηκαν αναποτελεσματικές ή μη πρακτικές και έτσι το ενδιαφέρον στράφηκε προς τις χημικές μεθόδους σταθεροποίησης των ούρων. Ο διαθέσιμος αριθμός χημικών ουσιών, οι οποίες παρεμποδίζουν τη μικροβιακή ανάπτυξη και πρωτεολυτική δράση είναι πάρα πολύ μεγάλος, αλλά δεν υπάρχει ένας και μόνο παράγοντας που να διαθέτει ταυτόχρονα ευρύ αντιβακτηριακό και αντιμυκητιασικό φάσμα δράσης, αλλά και ευρεία αντιπρωτεολυτική δράση. Ως αποτέλεσμα, ένα μίγμα χημικών σταθεροποιητικών παραγόντων, αποτελούμενο από αντιμικροβιακές ουσίες και διάφορους αναστολείς πρωτεασών σε μια σειρά πειραμάτων επώασης. Το πειραματικό πρωτόκολλο για τη σταθεροποίηση των ενδογενών στεροειδών επικεντρώθηκε στον ενοφθαλμισμό ούρων εμβολιασμένων με συζευγμένα και δευτεριωμένα πρότυπα στεροειδή, με επτά προκαρυωτικούς (βακτήρια) και δύο ευκαρυωτικούς (μύκητας, ζύμη) μικροοργανισμούς, παρουσία και απουσία του μίγματος σταθεροποιητικών παραγόντων. Και οι δύο σειρές υποδειγμάτων επωάστηκαν στους 37 °C επί μία εβδομάδα ή αποθηκεύτηκαν στους -20 °C για λόγους σύγκρισης. Oι εννέα επιλεγμένοι μικροοργανισμοί θεωρούνται αντιπροσωπευτικοί της φυσιολογικής μικροβιακής χλωρίδας, των ειδών που σχετίζονται με την εμφάνιση ουρολοιμώξεων, τη ρύπανση του αέρα εσωτερικών χώρων και επιπλέον διαθέτουν ένζυμα που ενδέχεται να προκαλέσουν αλλοίωση της κατανομής των στεροειδών υπό ορισμένες συνθήκες. Η εκτίμηση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η εισαγωγή του χημικού μίγματος σταθεροποιητών στα ούρα παρεμπόδισε τη μικροβιακή ανάπτυξη και πρόλαβε την αποδόμηση των στεροειδών στους 37 °C. Παράλληλα με τα πειράματα επώασης, διεξήχθη στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων από πραγματικά δείγματα ούρων αθλητών με στοιχεία αποδόμησης, τα οποία είχαν συλλεχθεί σε διάστημα δύο ετών, ώστε να διερευνηθεί η επίδραση παραμέτρων, όπως το φύλο, η ημερομηνία συλλογής, η χώρα προέλευσης, οι τιμές pH και sg. Κατεγράφησαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ του φύλου, της εποχής, της χώρας, των τιμών pH και του ύψους της κορυφής της 5α-ανδροσταν- 3,17-διόνης που σχηματίστηκε στα επιμολυσμένα δείγματα. Το πειραματικό πρωτόκολλο για τη σταθεροποίηση της ανασυνδυασμένης ερυθροποιητίνης περιλάμβανε δύο αλληλένδετες σειρές πειραμάτων. Έξι πρωτεολυτικά ένζυμα, αντιπροσωπευτικά των διαφόρων υποομάδων των ενδοπεπτιδασών, επιλέχθηκαν ανάλογα με τη διαθεσιμότητά τους και τη μεγάλη πιθανότητα να χρησιμοποιηθούν από τους αθλητές. Στην πρώτη σειρά πειραμάτων, υποδείγματα ούρων εμβολιασμένων με rEPO και πρωτεάσες επωάστηκαν, με και χωρίς το χημικό μίγμα σταθεροποιητών, στους 37 °C ή αποθηκεύτηκαν Περίληψη 184 στους -20 °C επί 7 ημέρες. Οι συγκεντρώσεις EPO προσδιορίστηκαν με μια αυτοματοποιημένη ανοσοενζυμική τεχνική. Μια δεύτερη σειρά πειραμάτων πραγματοποιήθηκε εντός συντομότερου χρονικού διαστήματος, 4 ημερών, με υποδείγματα ούρων που επωάστηκαν στους 37 °C ή αποθηκεύτηκαν στους -20 °C. Οι μετρήσεις EPO έγιναν χρησιμοποιώντας δύο αναλυτικές τεχνικές για λόγους σύγκρισης: την ανοσοενζυμική τεχνική και τη μέθοδο για την EPO που έχει υιοθετηθεί από τον WADA και βασίζεται στην ισοηλεκτρική εστίαση, διπλή αποτύπωση και ανίχνευση με χημειοφωταύγεια. Η εκτίμηση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η προσθήκη του χημικού μίγματος σταθεροποιητών πρόλαβε την ενζυμική πέψη της EPO από πρωτεάσες, μαζί με την αποθήκευση των δειγμάτων ούρων στους -20 °C. Για τη σταθεροποίηση της ακέραιης μορφής της hCG, τα πειράματα επώασης διεξήχθησαν κατά τη διάρκεια 4 ημερών, παρουσία και απουσία του μίγματος των σταθεροποιητών, σε υποδείγματα ούρων που είχαν εμβολιαστεί με έξι πρωτεάσες (πρώτη σειρά πειραμάτων) και έναν μικροοργανισμό, Escherichia coli (δεύτερη σειρά πειραμάτων). Τα επίπεδα της ακέραιης μορφής της hCG μετρήθηκαν με το εμπορικά διαθέσιμο κιτ EIAgen Total hCG. Συνολικά, τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν στην παρούσα εργασία απέδειξαν ότι το χημικό μίγμα σταθεροποιητών μπορεί να σταθεροποιήσει τα ενδογενή στεροειδή, την EPO και την hCG σε όλες σχεδόν τις πειραματικές συνθήκες που εξετάστηκαν, γεγονός που εξασφαλίζει την πρακτική εφαρμογή του σε ειδικά σχεδιασμένα δοχεία δειγματοληψίας, επιστρωμένα με το χημικό μίγμα σταθεροποιητών.