Φαιά σήψη πυρηνοκάρπων: μοριακός και βιολογικός χαρακτηρισμός παθογόνων αιτίων

Abstract

Brown rot is a devastating disease of stone fruits caused by Monilinia spp. The current study was conducted on the most important hosts (peach, apricot, sweet cherry and plums) to investigate the frequency of different Monilinia spp. in isolates obtained from blighted blossoms or fruit showing preharvest rots in Greece. From a total of 1433 isolates obtained from orchards located in the main stone fruit production regions of Greece, two Monilinia spp. were detected, Monilinia laxa and M. fructicola at frequencies of 59 and 41%, respectively. Monilinia fructicola was more common on fruit whereas M. laxa occurred in similar frequency on blossoms and fruit. In order to investigate the parameters involved in these differences, assessments of aggressiveness of isolates on the petals and fruits and measurements of the effect of temperature on mycelial growth were conducted for both species. M. fructicola isolates were more aggressive and also showed higher growth rates at higher temperatures while M. laxa isolates had a higher growth rate at the lower temperatures, which could explain the predominance of M. laxa during the lower temperatures in the blossom period. Furthermore, in order to investigate the possibility of the M. fructicola and M. laxa populations being specific to different stonefruit hosts and plant organs, a study of the genetic variation among 145 isolates of M. fructicola and 156 isolates of M. laxa collected from two distinct regions of Greece was conducted, using the intersimple-sequence repeat markers. The M. fructicola populations had higher genetic diversity compared with Μ. laxa populations in both regions sampled. The levels of genetic diversity were similar between populations obtained from diseased blossoms and fruit for each species. Based on the genetic distance, M. fructicola isolates from peach and apricot and from sweet cherry and plum were clustered together, while M. laxa isolates clustering based on the host of origin was not possible. The analysis of index of association showed the absence of sexual recombination for both species. The derived data supported the hypothesis of a long presence of M. fructicola in Greece, and provided evidence of specialization of M. fructicola populations based on their host of origin. In the 4th chapter, a high-resolution melting (HRM) method was developed and validated for the identification of the Monilinia spp. and for the detection of M. fructicola among other brown rot pathogens. Brown rot is caused by various Monilinia spp. including M. laxa, M. fructicola, M. fructigena, M. mumecola, M. linhartiana and M. yunnanensis. In the past identification of brown rot agents relied mainly on morphological differences, while later on various molecular methods were developed but required fungal isolation from the infected plant tissues. Based on the sequences of the cytb intron from isolates of the above mentioned Monilinia spp., a pair of universal primers for species identification and a pair of primers specific to M. fructicola were designed. The assay was validated with fungal isolates originating from several hosts and continents to cover, as much as possible, natural variations within the main Monilinia spp. The specificity of the primers was verified to ensure against cross-reaction with other fungal species and the sensitivity of the method was determined with known DNA concentrations. This novel assay has the potential for simultaneous identification and differentiation of the closely related Monilinia spp. as well as for the differentiation of M. fructicola. The objective of the last chapter was the proteomic characterization of the fruit of two peach cultivars "Rich Lady" and "Royal GLory" which differ in the level of resistance to brown rot pathogens, using the two-dimensional gel electrophoresis (2D-SDS-PAGE) analysis. More than 250 proteins were detected (P<0.05) while 120 protein spots showed greater than two-fold differences in their values. Functional analysis revealed that the differentially expressed proteins in "Royal Glory" involved in defense were increased in the fruit inoculated compared to control-fruit, while in "Rich Lady" the proteins of the same functional category were decreased in the inoculated fruit, compared to control-fruit. In order to validate the results of the proteomic analysis, the expression profile of six randomly selected defense-related genes was verified using quantitative RT-qPCR.

Η φαιά σήψη είναι η καταστρεπτικότερη ασθένεια των πυρηνόκαρπων που προκαλείται από είδη του γένους Monilinia. Σκοπός του 1ου ερευνητικού κεφαλαίου της διατριβής ήταν η διερεύνηση της συχνότητας παρουσίας των διαφορετικών ειδών του γένους Monilinia σε άνθη και καρπούς πυρηνοκάρπων στην Ελλάδα. Από τις 1433 απομονώσεις που συλλέχθηκαν από οπωρώνες που βρίσκονται στις κυριότερες περιοχές παραγωγής πυρηνόκαρπων στην Ελλάδα, ανιχνεύθηκαν δύο είδη, ο Monilinia laxa και ο M. fructicola, σε συχνότητες 59 και 41% αντίστοιχα. Ο M. fructicola βρέθηκε σε υψηλότερη συχνότητα σε καρπούς, ενώ ο M. laxa βρέθηκε σε παρόμοια συχνότητα, σε άνθη και καρπούς. Με σκοπό τη διερεύνηση των παραμέτρων που εμπλέκονται σε αυτές τις διαφορές, μετρήθηκε η μολυσματικότητα απομονώσεων των δύο ειδών σε πέταλα και σε καρπούς ξενιστών τους καθώς και η επίδραση της θερμοκρασίας στη μυκηλιακή τους αύξηση. Τα στελέχη του M. fructicola βρέθηκαν περισσότερο μολυσματικά και εμφάνισαν υψηλότερο ρυθμό αύξησης στις υψηλές θερμοκρασίες, ενώ τα στελέχη του M. laxa ήταν περισσότερο προσαρμοσμένα στις χαμηλές θερμοκρασίες, γεγονός που θα μπορούσε να εξηγήσει την επικράτηση του M. laxa την περίοδο της ανθοφορίας εξαιτίας των χαμηλότερων θερμοκρασιών που επικρατούν εκείνη την περίοδο. Στη συνέχεια με σκοπό τη διερεύνηση της πιθανής εξειδίκευσης των πληθυσμών M. fructicola και M. laxa σε διαφορετικούς ξενιστές πυρηνοκάρπων και όργανα προσβολής, πραγματοποιήθηκε μελέτη γενετικής παραλλακτικότητας 145 στελεχών του M. fructicola και 156 στελεχών του M. laxa, που συλλέχθηκαν από δύο διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας, με τη χρήση των δεικτών ενδο-επαναλαμβανόμενων απλών ακολουθιών (Intersimple-sequence repeat markers). Οι πληθυσμοί του M. fructicola εμφάνισαν υψηλότερη γενετική ποικιλομορφία σε σύγκριση με τους πληθυσμούς του M. laxa. Τα επίπεδα της γενετικής παραλλακτικότητας ήταν παρόμοια μεταξύ των πληθυσμών που απομονώθηκαν από προσβεβλημένα άνθη και καρπούς και για τα δύο είδη. Επιπλέον, η κατασκευή ενός δενδρογράμματος με βάση την γενετική απόσταση (ανάλυση Nei), έδειξε πως τα στελέχη του M. fructicola από ροδάκινο και βερίκοκο καθώς και τα στελέχη από κεράσι και δαμάσκηνο, ομαδοποιήθηκαν στους ίδιους κλάδους, ενώ η ομαδοποίηση των στελεχών του M. laxa, με βάση τον ξενιστή προέλευσής τους δεν ήταν δυνατή. Παράλληλα, η ανάλυση του δείκτη σύζευξης έδειξε την απουσία γενετικού ανασυνδυασμού και για τα δύο είδη. Τα παραπάνω δεδομένα, ενίσχυσαν την υπόθεση της μακράς παρουσίας του M. fructicola στην Ελλάδα και παρείχαν αποδείξεις εξειδίκευσης των πληθυσμών του M. fructicola με βάση τον ξενιστή προέλευσής τους. Στο 4ο κεφάλαιο αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε μια νέα μέθοδος ταυτοποίησης ειδών του γένους Monilinia, που στηρίζεται στην χρήση της ανάλυσης υψηλής διακριτικής ικανότητας καμπυλών τήξης (HRM). Η φαιά σήψη προκαλείται από διάφορα είδη του γένους Monilinia spp., συμπεριλαμβανομένων των M. laxa, M. fructicola, M. fructigena, M. polystroma, M. mumecola και M. yunnanensis. Στο παρελθόν η ταυτοποίηση των παθογόνων αιτιών της φαιάς σήψης στηριζόταν κυρίως σε διαφοροποιήσεις ως προς τα μορφολογικά χαρακτηριστικά μεταξύ των διαφόρων ειδών, ενώ αργότερα αναπτύχθηκαν και μοριακές μέθοδοι που ωστόσο απαιτούσαν την απομόνωση του παθογόνου από τους μολυσμένους ιστούς. Σχεδιάστηκαν δύο ζεύγη εκκινητών, το πρώτο για την ταυτοποίηση και διαχωρισμό των ειδών και το δεύτερο για την ανίχνευση του παθογόνου καραντίνας M. fructicola, με βάση τις αλληλουχίες ενός εσονίου στο γονίδιο του κυτοχρώματος b (cytb) από στελέχη των προαναφερθέντων ειδών. Για να καλυφθεί η φυσική παραλλακτικότητα εντός των ειδών, χρησιμοποιήθηκαν στελέχη από διάφορους ξενιστές και διαφορετικές ηπείρους, ενώ η εξειδίκευση και ευαισθησία της μεθόδου των εκκινητών της ανάλυσης HRM επαληθεύθηκε σε αντιδράσεις με DNA μυκήτων μη-στόχων καθώς και με τη χρήση γνωστών συγκεντρώσεων DNA των παθογόνων. Αυτή η νέα τεχνική παρείχε τη δυνατότητα της γρήγορης ταυτοποίησης στενά συγγενικών ειδών του Monilinia, ενώ επιπλέον διαχώρισε τον M. fructicola, ένα παθογόνο καραντίνας για την Ε.Ε., από άλλα κοινά παθογόνα ή σαπροφυτικούς μύκητες που αναπτύσσονται στους καρπούς των πυρηνοκάρπων. Σκοπός του τελευταίου κεφαλαίου ήταν ο πρωτεομικός χαρακτηρισμός των καρπών δύο ποικιλιών ροδακινιάς, των "Rich Lady" και "Royal Glory", που διαφέρουν ως προς το βαθμό ευπάθειάς τους στη φαιά σήψη, με τη χρήση της τεχνικής της δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακριλαμίδης, (2D-SDS-PAGE). Ανιχνεύθηκαν περισσότερες από 250 πρωτεΐνες (Ρ<0,05), ενώ σε 120 από αυτές, καταγράφηκε διαφοροποίηση (τουλάχιστον διπλασιασμός ή υποδιπλασιασμός) στην έκφρασή τους σε σχέση με τον αμόλυντο μάρτυρα. Η κατηγοριοποίηση των πρωτεϊνών με βάση τον λειτουργικό τους ρόλο, έδειξε πως στην ανθεκτική ποικιλία "Royal Glory" παρατηρήθηκε αύξηση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την άμυνα στους καρπούς που δέχθηκαν μόλυνση, σε σχέση με τους καρπούς του μάρτυρα, ενώ στην "Rich Lady" παρατηρήθηκε μείωση των πρωτεϊνών της ίδιας λειτουργίας, στους καρπούς που δέχθηκαν μόλυνση σε σχέση με τους καρπούς του μάρτυρα. Για την επαλήθευση των πρωτεομικών δεδομένων πραγματοποιήθηκε μια RT-qPCR με σκοπό τη μέτρηση του επιπέδου έκφρασης 6 τυχαία επιλεγμένων γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα των καρπών.