Δομική και βιοχημική μελέτη των πρωτεϊνών δέσμευσης οσμογόνων μορίων (Odorant Binding Protein, OBP) του ανωφελή κώνωπα (Anopheles gambiae)

Abstract

OBPs are a class of insect transport proteins that carry odorants from the air to the receptors of odorant neurons in the mosquito antennae. The structural and biochemical study of these proteins contributes to the understanding of the rules governing odorant recognition at the molecular level, and may lead to the development of new agents that can disrupt normal olfactory function of mosquitoes with enhanced affinity and specificity. Such compounds are intended to reduce the ability of mosquitoes to detect the human target and thus contribute to the reduction of disease transmission, such as malaria, carried by vectors.In the framework of this thesis we studied the odorant binding proteins of the Anopheles gambiae mosquito AgamOBP1, AgamOBP4, AgamOBP5 and AgamOBP48. The structural study of AgamOBP1 complexes with the two most widely used repellents, DEET and Icaridin, revealed a common binding mode of these compounds, the ability of stereoselective recognition of Icaridin from AgamOBP1 and a new repellent binding site. The study of AgamOBP4 revealed the flexibility of the protein at low pH. The structural determination of AgamOBP4 in complex with indole and 1-NPN revealed the existence of two distinct binding sub-sites, which can be exploited for the design of optimized ligands. AgamOBP48 constitutes the first example of a dipteran OBP that forms a stable 3D domain swapped homodimer, thereby creating a combined binding site. The fluorescence binding studies of a large number of compounds from the collection of USDA with known physiological activity in proteins AgamOBP1, -4 and -5, showed that compounds that bind strongly to OBPs not necessarily induce a desired physiological response in the mosquito.Overall, our results indicate that for the discovery and design of new repellents/attractants based on the structure of OBPs, besides the desired affinity, both the oligomerization state and the binding mode should be taken into account because, probably, the latter is the decisive factor for the selectivity and the manifestation of biological activity.

Οι ΟΒΡ είναι μια τάξη μεταφορικών πρωτεϊνών των εντόμων που μεταφέρουν οσμές από τον αέρα στους υποδοχείς των οσφρητικών νευρώνων στις κεραίες των κουνουπιών. Η δομική και βιοχημική μελέτη των πρωτεϊνών αυτών συντελεί στην κατανόηση των κανόνων που διέπουν την αναγνώριση των οσμών σε μοριακό επίπεδο και μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων διαταρακτών της φυσιολογικής οσφρητικής λειτουργίας των κουνουπιών με βελτιωμένη συγγένεια και εξειδίκευση. Τέτοιες ενώσεις αποσκοπούν στο να μειώσουν την ικανότητα των κουνουπιών να εντοπίζουν τον ανθρώπινο στόχο και έτσι να συμβάλλουν στη μείωση μετάδοσης ασθενειών, όπως η ελονοσία, που μεταφέρονται με διαβιβαστές.Στo πλαίσιo αυτής της διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν οι πρωτεΐνες δέσμευσης οσμογόνων μορίων του ανωφελή κώνωπα AgamOBP1, AgamOBP4, AgamOBP5 και AgamOBP48. Η κρυσταλλογραφική μελέτη των συμπλόκων της AgamOBP1 με τα δύο πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα εντομοαπωθητικά, του DEET και της Ικαριδίνης, αποκάλυψε ένα κοινό τρόπο πρόσδεσης, την ικανότητα στερεο-εκλεκτικής αναγνώρισης της Ικαριδίνης από την AgamOBP1 καθώς και ένα νέο κέντρο πρόσδεσης εντομοαπωθητικών. Η μελέτη της πρωτεΐνης AgamOBP4 αποκάλυψε την ευκαμψία της πρωτεΐνης σε όξινο περιβάλλον. Ο προσδιορισμός της δομής των συμπλόκων αυτής με το ινδόλιο και το 1-ΝΡΝ αποκάλυψε την ύπαρξη δύο διακριτών υποκέντρων πρόσδεσης που σε συνδυασμό μπορούν να τύχουν εκμετάλλευσης για το σχεδιασμό βελτιστοποιημένων προσδετών. Η πρωτεΐνη AgamOBP48 αποτελεί το πρώτο παράδειγμα στα δίπτερα μιας OBP που σχηματίζει ένα σταθερό ομοδιμερές τρισδιάστατης ανταλλαγής αυτοτελών περιοχών, δημιουργώντας έτσι ένα συνδυαστικό κέντρο πρόσδεσης. Η φθορισμομετρική μελέτη πρόσδεσης ενός μεγάλου αριθμού ενώσεων από την συλλογή του USDA με γνωστή φυσιολογική δράση στις πρωτεΐνες AgamOBP1, -4 και -5, έδειξε ότι ενώσεις που προσδένονται ισχυρά στις OBP δεν επάγουν απαραίτητα μια επιθυμητή φυσιολογική απόκριση στο κουνούπι.Συνολικά τα αποτελέσματά μας, υποδεικνύουν ότι για την ανακάλυψη και το σχεδιασμό νέων απωθητικών/ελκυστικών με βάση τη δομή των OBP θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη εκτός από την επιθυμητή συγγένεια, τόσο η κατάσταση ολιγομερισμού όσο και ο τρόπος σύνδεσης, αφού πιθανόν αυτός ο τελευταίος παράγοντας είναι ο καθοριστικός για την εκλεκτικότητα και την εκδήλωση της βιολογικής δράσης.