Συμβολή της μεθυλίωσης ως επιγενετικό φαινὀμενο στην ανάπτυξη προκαρκινωματωδών αλλοιώσεων του τραχήλου της μήτρας

Abstract

OBJECTIVE: Cervical cancer based on World Health Organization data, is second in frequency among women between the ages of 15-44 years and the third for all ages. In the development of cervical cancer necessary event considered the transfection by a high risk type of the human papillomavirus (HPV), but additive effect appear to have and other epigenetic phenomenon such as gene silencing, which include DNA methylation in the promoter of tumor suppressor genes.The aim of this study was to investigate the clinical significance of methylation detecting the methylation in eight promoter tumor suppressor genes and the importance of methylation of promoter in women default clinically healthy with an increased risk of cervical cancer of the uterus, and the correlation of epigenetic event with severity of intraepithelial lesion and the possibility of evolution. MATERIALS AND METHODS: All examinations were performed on the basis of project “AKAKOS” and project "HPVGuard 765 histologically confirmed cases and 959 liquid based cytology samples were used for detection of HPV DNA. For the methylation of the promoters of tumor suppressor genes was performed conversion of unmethylated cytosines to uracil after treatment with bisulfite. The methylation of CDKN2A, MGMT, hMLH-1 and SPARC was identified with methylation specific PCR (MSP) and their products analyzed in 2% agarose gel. The methylation of MAL-1, CADM-1, RARβ and DAPK1 performed by Real-time PCR using specific primers and Taqman probes (MethyLight), which separate the methylated from unmethylated form. RESULTS: Positivity for HPV DNA is statistically significant increase with increasing severity of the lesion both categories CIN2+ and CIN3+, with correlation of HPV 16, 31, 33, 52. In CIN2+ methylation has correlation with detection of 14HR (AUC 0.712), while in CIN3+ is correlated with detection of HPV16 (AUC 0.721). From the 8th analyzed genes best results showed the percentage of genes that were methylation followed by methylation of MAL-1 and SPARC for CIN2+ (AUC 0.654), for CIN3+ (AUC 0.706) and cancers (AUC 0.957). CONCLUSIONS: Methylation recognized important for CIN2+ and more important for CIN3+ and cancers. It is rare event in in pre-cancerous lesions and in younger women showing lower positivity and correlated with specific types of HPV.

ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ – ΣΚΟΠΟΣ : Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας, με βάση τα δεδομένα του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας, είναι δεύτερος σε συχνότητα στον γυναικείο πληθυσμό στις ηλικίες από 15 – 44 ετών και τρίτος για όλες τις ηλικίες. Αν και η επιμόλυνση με κάποιον ογκογόνο τύπο του ιού των ανθρωπίνων κονδυλωμάτων (HPV) θεωρείται αναγκαίο γεγονός για την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, συνεπικουρική δράση φαίνεται να διαθέτουν και άλλα μοριακά γεγονότα, όπως η επιγενετική αποσιώπιση ογκοκατασταλτικών γονιδίων, μέσω μεθυλίωσης του υποκινητή τους. Σκοπός της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση της κλινικής σημασίας της ανίχνευσης μεθυλίωσης στον υποκινητή οχτώ ογκοκατασταλτικών γονιδίων και η σημασία της μεθυλίωσης των υποκινητών στην προεπιλογή γυναικών κλινικά υγειών με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου τραχήλου της μήτρας, καθώς και η συσχέτιση του επιγενετικού γεγονότος με τη βαρύτητα της ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης και την πιθανότητα εξέλιξής της. ΥΛΙΚΟ – ΜΕΘΟΔΟΙ : Το υλικό της μελέτης αποτελείται από τμήμα των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων (Pap-test) γυναικών που είχαν ενταχθεί στα ερευνητικά έργα με τίτλους «Αυτοματοποιημένη Κυτταρολογική Ανίχνευση Κακοήθειας και η Οικονομοτεχνική Σημασία της» (ΑΚΑΚΟΣ) στα πλαίσια του προγράμματος ΠΕΠ Aττικής 2000-2006, μέτρο 1.2 και «Ένα σύστημα υποβοήθησης λήψης απόφασης βασισμένο σε κλινική διαγνωστική και θεραπευτική για αποδοτική και εξατομικευμένη διαχείριση των HPV συσχετιζόμενων ασθενειών», “HPVGuard”, Κωδικός έργου: 11ΣΥΝ_10_250 (ΣΥΝΕΡΓΑΣΙΑ 2011).Σε 765 ιστολογικά επιβεβαιωμένα περιστατικά και σε 959 δείγματα με κυτταρολογική διάγνωση πραγματοποιήθηκε τυποποίηση για HPV DNA. Για τη μεθυλίωση των υποκινητών των οχτώ ογκοκατασταλτικών γονιδίων πραγματοποιήθηκε μετατροπή των μη-μεθυλιωμένων κυτοσινών σε ουρακίλη, μετά από επίδραση με bisulfite. PCR με ειδικούς για μεθυλίωση υποκινητές και ανάλυση των τελικών προϊόντων σε πήκτωμα αγαρόζης 2% πραγματοποιήθηκε για τα CDKN2A, MGMT, hMLH-1 και SPARC. Ενώ για MAL-1, CADM-1, RARβ και DAPK πραγματοποιήθηκε Real-time PCR με χρήση ειδικών εκκινητών και κατάλληλων Taqman ιχνηθετών (MethyLight), οι οποίοι διαχώριζαν τη μεθυλιωμένη από τη μη-μεθυλιωμένη μορφή. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η θετικότητα για HPV DNA εμφάνισε στατιστικά σημαντική αύξηση με την αύξηση της βαρύτητας της αλλοίωσης και στις κατηγορίες CIN2+ και CIN3+, με σημαντική συσχέτιση με τα στελέχη HPV 16, 31, 33, 52. Στις CIN2+ αλλοιώσεις η σημαντικότερη συσχέτιση με τον HPV βρέθηκε με την παρουσία κάποιου από τους 14HR (AUC 0.712), ενώ στις CIN3+ η σημαντικότερη αναδείχθηκε με την ανίχνευση του HPV16 (AUC 0.721). Από τα αναλυθέντα γονίδια καλύτερα αποτελέσματα παρουσίασε το ποσοστό των γονιδίων που είχαν μεθυλίωση τόσο στα CIN2+ (AUC 0.654) όσο και στα CIN3+ (AUC 0.706) και τους καρκίνους (AUC 0.957). Σε μεμονωμένα γονίδια τα καλύτερα αποτελέσματα παρουσίασαν το MAL-1 και το SPARC. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ : Η μεθυλίωση αναγνωρίστηκε σημαντική για CIN2+ και σημαντικότερη για CIN3+ και καρκίνους, ενώ αποτελεί όψιμο γεγονός στις προ-καρκινωματώδεις αλλοιώσεις, δείχνοντας χαμηλότερη θετικότητα στις νεότερες γυναίκες και συσχέτιση με συγκεκριμένους τύπους HPV.