Νέες μοριακές προσεγγίσεις για την αύξηση των επιπέδων της λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL) στο ήπαρ και την θεραπεία της στεφανιαίας νόσου

Abstract

The aim of the present PhD thesis was to investigate the molecular mechanismsthat control the expression of genes that are involved in lipoprotein metabolism and toidentify new molecular approaches that increase HDL levels in plasma.Lipoprotein metabolism involves the transport of lipids, particularly cholesteroland triglycerides, from intestine and liver to peripheral tissues and from peripheryback to the liver (reverse cholesterol transport) and is facilitated by numerous proteinsincluding apolipoproteins, membrane transporters, plasma enzymes and lipoproteinreceptors. Lipoprotein lipase (LPL) plays a critical role in lipoprotein remodeling bycatalyzing the hydrolysis of triglycerides (TGs) present in TG-rich lipoproteinparticles such as very low density lipoprotein (VLDL) and chylomicrons (CMs) tofree fatty acids for the subsequent storage in adipose tissue or utilizations for theproduction of energy by various tissues. LPL is expressed primarily in the adiposetissue but it is also expressed at lower levels in other tissues including the liver. Therole of LPL in the adult liver has been controversial due its low levels of expressionbut recent studies in mouse models of liver LPL overexpression or deficiency haverevealed important new roles of the enzyme in glucose and lipid metabolism.In Part I we characterized the mechanism that controls the expression of humanLPL in hepatic cells at the level of transcription. First, we cloned the human LPLpromoter and performed a deletion analysis using transactivation assays in humanhepatoblastoma HepG2 cells. We revealed that the proximal region -109/-28 isimportant for basal hepatic LPL promoter activity. An in silico analysis of this regionshowed that it harbors a putative binding site, at position -47/-40, for the hepatictranscription factor forkhead box A2 (FOXA2) or Hepatocyte Nuclear factor 3β(HNF-3β), shown previously to play important roles in lipid and glucose homeostasis.Silencing of endogenous FOXA2 expression in HepG2 cells (using a specific siRNA)reduced the LPL mRNA and protein levels. Direct binding of FOXA2 to the novelbinding site was established using chromatin immunoprecipitation assays, ex vivo andDNA affinity precipitation assays in vitro. This element was further characterized bysite directed mutagenesis and it was found that five nucleotide substitutions in theFOXA2 site abolished the binding of FOXA2 and reduced the basal activity of theLPL promoter and the FOXA2-mediated transactivation. Next, we studied the effect of insulin on the hepatic regulation of the LPL gene in HepG2 cells and we showedthat insulin induces the phosphorylation of AKT and the nuclear export of FOXA2causing a reduction in the LPL mRNA levels and promoter activity. Based on thesefindings, we proposed a novel role of FOXA2 in the regulation of the human LPLgene in hepatic cells by insulin.In Part II we elucidated the mechanism of regulation of the human LPL gene byLiver X Receptors (LXR) in hepatic cells. Previous studies in mice had shown that theexpression of LPL gene in the liver is strongly induced by high fat diets and syntheticagonists that activate the nuclear receptors LXR and RXR (Retinoid X Receptor). Inagreement with these findings, we showed that treatment of HepG2 cells or primarymouse hepatocytes with the LXR synthetic agonist T0901317 upregulated theexpression of LPL gene in mRNA and protein levels. Moreover, the nuclear receptorsLXRα and RXRα transactivated strongly the human LPL promoter in response totheir ligands in HepG2 cells and deletion analysis of the human LPL promoterestablished that the minimal region required for LXR/RXR transactivation was the -109/-28, which involves the FOXA2 binding site. Interestingly, we demonstrated veryweak binding of nuclear receptors LXRα and RXRα to the proximal human LPLpromoter, using chromatin immunoprecipitation assays, suggesting that additionalfactors are required for LXR action. Silencing of the endogenous FOXA2 gene usinga specific siRNA in HepG2 cells and in mouse primary hepatocytes caused aninhibition of the oxysterol-inducible expression of LPL gene at both the mRNA andprotein levels. Importantly, insulin, which inactivates FOXA2 via its nuclearexclusion, reduced the oxysterol-inducible expression of LPL gene, indicating theimportance of FOXA2 in the lipid homeostasis in the liver. Next, we found thatFOXA2 and ligand-activated LXRα/RXRα transactivated the human LPL promoter ina synergistic fashion. The mutations in the FOXA2 binding site (-47/-40) inhibited thesynergistic transactivation of the LPL promoter by FOXA2 and LXRα/RXRα. Finally,we performed co-immunoprecipitation and GST pull down assays and establishedphysical interactions between FOXA2, LXRα and RXRα in vitro and in vivo. Anextended DNA binding domain (DBD) of LXRα is required for physical interactionswith the at least one of the two transactivation domains of FOXA2. In conclusion, thefindings of Part I and II suggest that the newly identified FOXA2 binding site in theLPL promoter serves as a novel LXRE that facilitates the induction of the LPL geneby oxysterols via FOXA2. Through an insulin-AKT-FOXA2-LPL signaling pathway the overexpression of LPL is prevented in the liver under conditions of cholesteroloverload protecting this tissue from the toxic effects of LPL.In Part III we focused on the regulation of genes that are involved in HDLbiogenesis and the remodeling by transcription factor FOXA2 and LXRs in hepaticcells. Previous studies had shown that mice heterozygous for FOXA2 have reducedlevels of HDL in the plasma. Using in silico analysis, we identified putative bindingsites for the FOXA2 factor in proximity with characterized LXR responsive elements(LXREs) in the promoters of various human HDL genes encoding the lipidtransporters ABCG1, the hepatic lipase (LIPC) and the cholesteryl ester transferprotein (CETP). In agreement with previous studies, we showed that treatment ofHepG2 cells and primary mouse hepatocytes with the synthetic LXR ligand,T0901317, caused a strong induction of mRNA levels of ABCG1, ABCG5, ABCG8and CETP genes. Inactivation of the FOXA2 factor by siRNA silencing or insulin inprimary mouse hepatocytes and HepG2 cells reduced the basal mRNA levels and alsothe induction of ABCG5 and ABCG8 genes, by T0901317, indicating that FOXA2 iscritical for the upregulation of these lipid transporters by the LXR ligands. Withtransactivation assays, we established that FOXA2 or LXRα/RXRα overexpression inthe presence of their ligands in HepG2 cells increased the activity of the promoters ofthe ABCG5 and ABCG8 genes. In agreement with these findings, silencing theexpression of LXRα or LXRβ in HepG2 cells, via lentivirus expressing shRNAsspecific for each LXR isoform, reduced the mRNA levels of ABCG8 and ABCG5genes. Furthermore, FOXA2 and ligand-activated LXRα/RXRα transactivated in asynergistic manner the promoter of ABCG8 gene, but not the ABCG5 promoter.Unexpectedly, FOXA2 inhibited the induction of the ABCG5 promoter by LXRs andoxysterols in HepG2 cells, suggesting that more distal transcription factor bindingsites far from the coding regions of the genes may be involved and via DNA loopingregulate coordinately the expression of ABCG5 and ABCG8 genes. These findingsare in line with the synergistic transactivation of LPL promoter by nuclear receptorsLXRα/RXRα and the transcription factor FOXA2, as described above.Understanding in depth the mechanisms by which lipid and glucose metabolicpathways are interconnected in the liver by factors such as FOXA2 may open the wayto novel therapeutic strategies to increase HDL levels and protect patients withmetabolic diseases such as coronary heart disease, dyslipidemia, diabetes and themetabolic syndrome.

Οι κύριοι ερευνητικοί στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν νααπαντηθούν ερωτήματα που αφορούν στη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών πουρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό τωνλιποπρωτεϊνών στο ήπαρ και να τακτοποιηθούν νέες μοριακές στρατηγικές για τηναύξηση των επιπέδων της HDL στο πλάσμα.Ο μεταβολισμός των λιποπρωτεϊνών περιλαμβάνει τη μεταφορά λιπιδίων,ιδιαίτερα χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων, από το έντερο και το ήπαρ προς τουςπεριφερικούς ιστούς και αντίστροφα από τη περιφέρεια πίσω στο ήπαρ (αντίστροφημεταφορά χοληστερόλης). Στα μονοπάτια αυτά εμπλέκονται πολλές πρωτεΐνες,συμπεριλαμβανομένων των απολιποπρωτεϊνών, μεμβρανικοί μεταφορείς, ένζυμα τουπλάσματος και υποδοχείς λιποπρωτεϊνών. Η λιποπρωτεινική λιπάση (LPL) παίζεισημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών καθώς καταλύει την υδρόλυσητων τριγλυκεριδίων που βρίσκονται στα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια πλούσια σετριγλυκερίδια, όπως είναι τα χυλομικρά και η VLDL (very low density lipoprotein).Τα λιπαρά οξέα που ελευθερώνονται στους ιστούς αποθηκεύονται στο λιπώδη ιστό ήχρησιμοποιούνται για παραγωγή ενέργειας από διάφορους ιστούς. Η LPL εκφράζεταισε υψηλά επίπεδα κυρίως στο λιπώδη ιστό και τους μύες, αλλά ανιχνεύεται σεχαμηλά επίπεδα σε άλλους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου και του ήπατος. Ο ρόλοςτης LPL στο ενήλικο ήπαρ είναι αμφιλεγόμενος εξαιτίας των χαμηλών επιπέδωνέκφρασης της σ αυτόν τον ιστό. Παρ’ όλα αυτά, πρόσφατες μελέτες σε μοντέλαποντικών στα οποία υπερκεράζεται ή απαλείφεται η LPL στο ήπαρ, έχουν αναδείξειτη σημαντικότητα αυτού του ενζύμου στο μεταβολισμό των λιπιδίων και τηςγλυκόζης.Στην Ενότητα Ι, χαρακτηρίσαμε το μηχανισμό που ρυθμίζει την έκφραση τουγονιδίου LPL του ανθρώπου στα ηπατικά κύτταρα σε μεταγραφικό επίπεδο. Αρχικάκλωνοποιήσαμε τον υποκινητή της ανθρώπινης LPL και πραγματοποιήσαμε ανάλυσητων απαλοιφών του υποκινητή της LPL με πειράματα παροδικής διαμόλυνσηςκυττάρων HepG2. Παρατηρήσαμε ότι η κοντινή περιοχή -109/-28 του υποκινητήείναι σημαντική για τη βασική ηπατική ενεργότητα του υποκινητή του γονιδίου LPL.Με βιοπληροφορική ανάλυση αυτής της περιοχής εντοπίστηκε μια πιθανή θέσηπρόσδεσης (-47/-40) για τον παράγοντα FOXA2 (HNF3β), ο οποίος παίζει σημαντικόρόλο στην ομοιόσταση των λιπιδίων και της γλυκόζης. Αποσιώπηση της έκφρασης της ενδογενούς πρωτεΐνης FOXA2 στα κύτταρα HepG2 (χρησιμοποιώντας ένα ειδικόsiRNA), οδήγησε σε μείωση των επιπέδων πρωτεΐνης και mRNA του γονιδίου LPL.Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης και αλληλεπίδρασης DNA-πρωτεϊνώνέδειξαν ότι ο μεταγραφικός παράγοντας FOXA2 προσδένεται στην κοντινή περιοχή -141/-10 του υποκινητή της LPL. Αυτό το ρυθμιστικό στοιχείο χαρακτηρίστηκεπεραιτέρω με μεταλλαξιγένεση. Μεταλλάξεις πέντε βάσεων στη θέσης πρόσδεσηςτου FOXA2 (-47/-40) κατάργησαν την πρόσδεση του FOXA2 στη θέση αυτή καιμείωσαν σημαντικά τόσο τη βασική ενεργότητα του υποκινητή της LPL όσο και τηνενεργοποίηση του υποκινητή από τον παράγοντα FOXA2. Στη συνέχεια, μελετήσαμετην επίδραση της ινσουλίνης στην ηπατική ρύθμιση του γονιδίου LPL στα κύτταραHepG2. Παρατηρήσαμε ότι η ινσουλίνη αύξησε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης τηςΑΚΤ και οδήγησε σε αποκλεισμό του FOXA2 από τον πυρήνα, το οποίο στησυνέχεια προκάλεσε μείωση των επιπέδων mRNA του γονιδίου LPL και τηςενεργότητας του υποκινητή. Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ένα νέο ρόλοτου παράγοντα FOXA2 στη ρύθμιση του γονιδίου LPL του ανθρώπου από τηνινσουλίνη, στα ηπατικά κύτταρα.Στην Ενότητα ΙΙ, διερευνήσαμε το μηχανισμό ρύθμισης του γονιδίου LPLτου ανθρώπου από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXR (Liver X Receptors) στα ηπατικάκύτταρα. Προηγούμενες μελέτες σε μοντέλα ποντικών είχαν δείξει ότι η έκφρασή τουγονιδίου LPL στο ήπαρ επάγεται ισχυρά από δίαιτες υψηλές σε χοληστερόλη ή απόσυνθετικούς LXR αγωνιστές που ενεργοποιούν τους πυρηνικούς υποδοχείς LXR καιRXR (Retinoid X Receptor). Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, δείξαμε ότι επώασηκυττάρων HepG2 ή πρωτογενών ηπατοκυττάρων ποντικού με τον συνθετικό LXRαγωνιστή T0901317 αύξησαν την έκφραση του γονιδίου της LPL τόσο σε επίπεδόRNA όσο και πρωτεϊνών. Επίσης η υπερέκφραση του ετεροδιμερούς LXRα/RXRα σεκύτταρα HepG2 παρουσία των συνδετών τους, ενεργοποίησε ισχυρά τον υποκινητή -883/+39 της ανθρώπινης LPL. ανάλυση των απαλοιφών του υποκινητή της LPLέδειξαν ότι η ελάχιστη περιοχή που απαιτείται για την ενεργοποίηση από ταετεροδιμερή LXRα/RXRα ήταν η -109/-28, η οποία περιλαμβάνει τη θέση πρόσδεσηςτου FOXA2. Ενδιαφέρον παρουσιάζει, το γεγονός ότι οι υποδοχείς LXRα και RXRαπροσδένονται πολύ ασθενικά στον υποκινητή του γονιδίου LPL, όπως διαπιστώθηκεμε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης, υποδεικνύοντας ότι επιπλέονπαράγοντες απαιτούνται για την δράση των LXR. Αποσιώπηση της έκφρασης τηςενδογενούς πρωτεΐνης FOXA2 στα κύτταρα HepG2 και σε πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού, χρησιμοποιώντας ένα ειδικό siRNA, προκάλεσε δραματική μείωση τηςεπαγωγής της έκφρασης του γονιδίου LPL από τον συνδέτη του LXR, T0901317, σεεπίπεδο πρωτεΐνης και mRNA. Αξιοσημείωτη είναι η διαπίστωση ότι η ινσουλίνη, ηοποία απενεργοποιεί τον παράγοντα FOXA2 μέσω πυρηνικού του αποκλεισμού,μείωσε την επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου LPL από τις οξυστερόλες,υποδεικνύοντας της σημαντικότητα του παράγοντα FOXA2 στην ομοιόσταση τωνλιπιδίων στο ήπαρ. Έπειτα, παρατηρήσαμε ότι η ταυτόχρονη υπερέκφραση τηςπρωτεΐνης FOXA2 και των LXRα/RXRα, παρουσία των συνδετών τους,ενεργοποίησε τον υποκινητή της LPL κατά έναν συνεργατικό τρόπο.Καταστρέφοντας τη θέση πρόσδεσης του παράγοντα FOXA2 (με τις μεταλλάξειςπου αναφέρθηκαν παραπάνω), αναστάλθηκε σημαντικά η συνεργατική ενεργοποίησητου υποκινητή της LPL από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXRα/RXRα και τονπαράγοντα FOXA2.Τέλος, πραγματοποιήσαμε πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισηςκαι δοκιμασίες GST pull down και δείξαμε ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες FOXA2και LXR/RXR αλληλεπιδρούν φυσικά in vivo και in vitro. Μια εκτεταμένη DBD(DNA binding domain) περιοχή του υποδοχέα LXRα απαιτείται για τη τις φυσικέςαλληλεπιδράσεις με τουλάχιστον μία από τις δύο περιοχές ενεργοποίησης(transactivation domains) του FOXA2. Συνοψίζοντας, τα ευρήματα των Ενοτήτων Ικαι ΙΙ υποδεικνύουν ότι ή νέα θέση πρόσδεσης του παράγοντα FOXA2 στονυποκινητή της LPL λειτουργεί σαν ένα νέο ρυθμιστικό στοιχείο LXRE, το οποίοδιευκολύνει την επαγωγή του γονιδίου LPL από τις οξυστερόλες μέσω τουπαράγοντα FOXA2. Μέσω ενός σηματοδοτικού μονοπατιού ινσουλίνης- AKTFOXA2-LPL η υπερέκφραση της LPL στο ήπαρ εμποδίζεται σε συνθήκες περίσσειαςχοληστερόλης, προστατεύοντας τον ιστό αυτό από τις τοξικές δράσεις της LPL.Στην Ενότητα ΙΙΙ, εστιαστήκαμε στην ρύθμιση γονιδίων που συμμετέχουν στηβιογένεση και αναδιαμόρφωση της HDL από τους μεταγραφικούς παράγοντεςFOXA2 και LXRs στα ηπατικά κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι σεποντίκια ετερόζυγα για τον παράγοντα FOXA2, τα επίπεδα της HDL στο πλάσμαείναι μειωμένα. Με βιοπληροφορική ανάλυση, εντοπίστηκαν πιθανές θέσειςπρόσδεσης για τον παράγοντα FOXA2 που βρίσκονται κοντά σε χαρακτηρισμέναρυθμιστικά στοιχεία LXRE, στους υποκινητές των γονιδίων ABCG1, LIPC καιCETP. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, παρατηρήσαμε ότι η επώασηκυττάρων HepG2 και πρωτογενών ηπατοκυττάρων ποντικού με τον συνθετικό LXRαγωνιστή , T0901317, προκάλεσε ισχυρή επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων ABCG1, ABCG5, ABCG8 και CETP, σε επίπεδο mRNA. Απενεργοποίηση τουπαράγοντα FOXA2, μέσω siRNA αποσιώπησης είτε μέσω επίδρασης με ινσουλίνη σεπρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού ή σε κύτταρα HepG2, μείωσε τα βασικά επίπεδαmRNA αλλά και την επαγωγή των ABCG5 και ABCG8 γονιδίων, από τον αγωνιστήT0901317, υποδεικνύοντας ότι ο FOXA2 έχει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίησηαυτών των μεταφορέων λιπιδίων από τους συνδέτες των πυρηνικούς υποδοχείς LXR.Πραγματοποιώντας πειράματα παροδικής διαμόλυνσης σε κύτταρα HepG2παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης FOXA2 ή των υποδοχέωνLXRα/RXRα οδήγησε σε αύξηση της ενεργότητας των υποκινητών των γονιδίωνABCG5 και ABCG8. Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, αποσιώπηση τηςέκφρασης της ενδογενούς πρωτεΐνης LXRα ή LXRβ στα κύτταρα HepG2, μέσωλεντιïών που εκφράζουν ειδικά shRNAs για κάθε ισομορφή των LXR, μείωσε ταεπιπέδων mRNA των γονιδίων ABCG5 και ABCG8. Επιπλέον, η ταυτόχρονηυπερέκφραση των πρωτεϊνών FOXA2 και LXRα/RXRα, παρουσία των συνδετώντους ενεργοποίησε κατά έναν συνεργατικό τρόπο τον υποκινητή του γονιδίουABCG8, αλλά όχι τον υποκινητή του γονιδίου ABCG5. Αντίθετα, ο FOXA2ανέστειλε την επαγωγή του υποκινητή του γονιδίου ABCG5 από τους LXRs και τιςοξυστερόλες στα κύτταρα HepG2, υποδεικνύοντας την ύπαρξη απομακρυσμένωνρυθμιστικών στοιχείων και μεταγραφικών παραγόντων, τα οποία ίσως συνδέονται μελούπες του DNA και με αυτόν τον τρόπο ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίωνABCG5 και ABCG8. Τα ευρήματα αυτά έρχονται σε συμφωνία με την συνεργατικήενεργοποίηση του υποκινητή της LPL από τους πυρηνικούς υποδοχείς LXRα/RXRακαι τον παράγοντα FOXA2, όπως περιγράφηκε παραπάνω.Η κατανόηση σε βάθος των μηχανισμών, με τους οποίους συνδέονται ταμεταβολικά μονοπάτια λιπιδίων και γλυκόζης στο ήπαρ από παράγοντες όπως οFOXA2 είναι ιδιαίτερα σημαντική για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικώνστρατηγικών για την αύξηση των επιπέδων της HDL και την προστασία ασθενών μεμεταβολικές ασθένειες, όπως η καρδιαγγειακή νόσος, ο διαβήτης, οι δυσλιπιδαιμίεςκαι το μεταβολικό σύνδρομο.