Αλληλορυθμιζόμενα μονοπάτια έκφρασης ηπατικών μεταγραφικών παραγόντων

Abstract

Studies on transcriptional regulation of liver specific genes have resulted in the identification of a set o transcription factors that determine their liver specific expression. These liver enriched hepatic regulators are HNF-1α,-1β,-3α,-3β,-3γ,-4α and -6, members of C/EBP και GATA families, as well as some nuclear receprors such as LRH-1 and COUP-TFII. In order to investigate the hierarchical networks that may operate during hepatocyte differentiation the present study was focused on mapping all of the crossregulatory interactions between the hepatic regulators during embryonic and postnatal liver development. In order to accomplish this we analyzed the expression levels of the 12 main hepatic regulators and the occupancy of their regulatory regions by each other after embryonic day 12.5, when the specification phase is complete and hepatoblast differentiation is taking place. We also performed a similar analysis in HNF-4a-deficient embryonic and adult mouse livers to assess the role of this central activator in the composition and stability of the network. The comprehensive map of interactions, combined with expression studies reveal that, during the studied developmental periods, cross-regulatory motifs are built up progressively to generate a highly flexible, self-sustaining transcription factor network. In summary the results of this study point to the progressive build-up of a highly interconnected transcription factor network during hepatocyte development. The network exhibits an unusually high level of plasticity in terms of regulatory effects, which provides the molecular basis for observations pertaining to dominant and redundant functions of its individual members. We have also studied the potential role of MAP kinase regulation on HNF-4 expression, and more specifically the effect of Erk2 activation in transcriptional regulation of ΗNF-4α in human hepatoma cells. We investigated the mechanism by which ΗNF-4α transcriptional status was changed as well as the role of C/EBPα in this mechanism.Taken together the data suggested that during MAP kinase activation the HNF-4 enhancer-promoter complex was disrupted. Upon the seizure of the signal, C/EBPα was re-expressed and the communication between the enhancer and the promoter was restored with parallel activation of transcription of the HNF-4α gene. Finally, we tried to accomplish a histological and phenotypical analysis of ΗNF-4αKO liver, in order to understand the role of ΗNF-4α in the maintenance of hepatic architecture and we focused on the study of genes that potentially are responsible for the disorganized hepatic phenotype. Τhe results of this study showed that HNF-4α has an essential role in the maintenance of hepatic phenotype and architecture and seems to be either directly or indirectly involved in the transcriptional regulation of genes coding for proteins which are responsible for cell to cell contacts.

Μελέτες πάνω στη ρύθμιση ηπατοειδικών γονιδίων, έχουν οδηγήσει στην ταυτοποίηση ενός συνόλου μεταγραφικών παραγόντων που καθορίζουν την αποκλειστική έκφρασή τους στο ήπαρ. Οι κυριότεροι από αυτούς τους μεταγραφικούς παράγοντες που εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα στο ήπαρ είναι οι HNF-1α,-1β,-3α,-3β,-3γ,-4α και -6, μέλη της C/EBP και GATA οικογένειας, καθώς και πυρηνικοί υποδοχείς όπως οι LRH-1 και COUP-TFII. Μέχρι τώρα υπάρχουν αρκετές in vivo ενδείξεις που στηρίζουν την υπόθεση της ύπαρξης ενός πολύπλοκου δικτύου αλληλορυθμίσεων των κυριότερων μεταγραφικών παραγόντων, το οποίο λειτουργεί στα διαφοροποιημένα ηπατοκύτταρα και που φαίνεται να είναι υπεύθυνο τόσο για τον καθορισμό όσο και για τη διατήρηση του ηπατικού φαινοτύπου, διασφαλίζοντας ταυτόχρονα την ισορροπημένα υψηλή έκφραση των παραγόντων αυτών στα ηπατοκύτταρα. Στη διερεύνηση της ύπαρξης ιεραρχικών δικτύων μεταξύ των κύριων ηπατικών ρυθμιστών εστιάστηκε η μελέτη που ακολουθεί με σκοπό την χαρτογράφηση όλων των μεταγραφικών αλληλορυθμίσεων ανάμεσα στους ηπατικούς μεταγραφικούς παράγοντες κατά τα στάδια τόσο της εμβρυικής όσο και μετά τη γέννηση ηπατικής ανάπτυξης του ποντικιού. Για τον λόγο αυτό αναλύθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των 12 κυριότερων ηπατικών ρυθμιστών καθώς και τα πρότυπα στρατολόγησής τους στους υποκινητές των γονιδίων τους μετά την Ε12.5 εμβρυική μέρα, στην οποία έχει ολοκληρωθεί το στάδιο καθορισμού και έχει ήδη ξεκινήσει η διαφοροποίηση των ηπατοβλαστών. Επίσης πραγματοποιήθηκε μια αντίστοιχη ανάλυση στο ήπαρ εμβρύων και ενήλικων ποντικιών που είχαν υποστεί την ηπατοειδική εξάλειψη της έκφρασης του HNF-4α, με σκοπό να διασαφηνισθεί ο ρόλος αυτού του σημαντικού ηπατικού παράγοντα στη σύνθεση και τη σταθερότητα του μεταγραφικού δικτύου. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν τη βαθμιαία εγκαθίδρυση ενός υψηλής πολυπλοκότητας δικτύου μεταγραφικών παραγόντων κατά την ανάπτυξη. Το δίκτυο αυτό διακρίνεται από ένα ασυνήθιστα υψηλό επίπεδο πλαστικότητας όσον αφορά τις ρυθμιστικές επιδράσεις, που παρέχει τις μοριακές βάσεις για παρατηρήσεις που έχουν σχέση με κυρίαρχες ή δευτερεύουσες λειτουργίες των επιμέρους μεταγραφικών παραγόντων. Επιπλέον μελετήθηκε η μεταγραφική απόκριση του HNF-4α υπό συνθήκες ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού των ΜΑΡ κινασών και συγκεκριμένα η επίδραση της ενεργοποίησης του Erk2 στην έκφραση του HNF-4α σε ανθρώπινα καρκινικά ηπατικά κύτταρα. Στη συνέχεια διερευνήθηκε ο μηχανισμός μέσω του οποίου προκαλείται η αλλαγή στη μεταγραφική κατάσταση του γονιδίου του HNF-4α και ο ρόλος του C/EBPα σε αυτόν τον μηχανισμό. Τα πειραματικά δεδομένα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι κατά την ενεργοποίηση του μονοπατιού των ΜΑΡ κινασών, μειωνόταν δραματικά η έκφραση του C/EBPα, γεγονός που οδηγούσε στην αποδιοργάνωση της επικοινωνίας ενισχυτή-υποκινητή του HNF-4α γονιδίου και στη μεταγραφική απενεργοποίηση και του τελευταίου. Ο C/EBPα άρχιζε να επανεκφράζεται μετά την απομάκρυνση του σήματος με αποτέλεσμα την αποκατάσταση της επικοινωνίας ενισχυτή-υποκινητή γεγονός που οδηγούσε ταυτόχρονα σε μεταγραφική ενεργοποίηση του HNF-4α γονιδίου. Τέλος πραγματοποιήθηκε μια προσπάθεια ιστολογικής και φαινοτυπικής ανάλυσης στο ενήλικο HNF-4αΚΟ ήπαρ, η οποία είχε σαν στόχο την κατανόηση του ρόλου του HNF-4α στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής της ηπατικής δομής και εστιάστηκε στη διερεύνηση των γονιδίων που επηρεάζονται από την απουσία αυτού του μεταγραφικού παράγοντα και προφανώς ευθύνονται για τον αποδιοργανωμένο ηπατικό φαινότυπο. Από τη μελέτη αυτή διαπιστώθηκε ότι ο HNF-4α παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση του ηπατικού φαινοτύπου και της ηπατικής αρχιτεκτονικής και φάνηκε να εμπλέκεται άμεσα ή έμμεσα στη ρύθμιση γονιδίων έκφρασης πρωτεϊνών που ευθύνονται για τις διακυτταρικές συνδέσεις καθώς και γονιδίων που ρυθμίζουν την ομοιόσταση των λιπιδίων στο ήπαρ