Μελέτη της καρκινογένεσης σε θυλακιοκυτταρικά καρκινώματα θυρεοειδούς

Abstract

IntroductionApoptosis is an important process in tissue homeostasis, controlling abnormalcell growth and regulating immune responses. Of particular interest is thestudy of apoptosis in malignant tumors.The tumor suppressor gene p53 has been found to induce apoptosis in caseof cell damage, by activating pathways that cause cell death. Among thesepathways, that of the transmembrane receptor Fas is included. The fas genetherefore seems to be one of the objectives of the p53 protein actions.The Fas receptor, a member of the Tumor Necrosis Factor Receptor (TNFR)family, exemplifies receptor inducing apoptosis when activated by appropriatestimuli. The apoptotic effect is the culmination of a sequence of events,activation and interaction of protein molecules that occur inside the cell. Byactivating the receptor Fas, a complex (DISC complex) is formed with theparticipation of the receptor’s cytoplasmic end and FADD, FLIP and proenzymepro-caspase 8 proteins. The incorporation of pro-caspase 8molecules in DISC complex substantially activates caspase 8, which in turnactivates other proteases. This creates a "waterfall" caspase activation cascade of events that ultimately cause cell death, as indeed is the challengeof apoptosis.AimAim of this thesis was to evaluate p53 and fas genes for possible mutations,to investigate the expression of soluble Fas receptor mRNA, the study of theprotein components expression of the Fas receptor apoptotic pathway and tosearch for a possible explanation of the resistance of thyroid cancer cells tothis pathway, through a possible absence of expression of a componentprotein.Material and methodsIn total, 80 thyroid biopsy specimens (71 papillary Ca, 2 follicular Ca, 2anaplastic Ca, 2 Hürthle Ca, 2 mixed Ca and one hyperplastic nodule) were 8retrieved from the archives of the 1st Department of Pathology, MedicalSchool, National and Kapodistrian University of Athens.Thyroid carcinoma samples were evaluated on DNA, RNA and protein level.Initially, DNA was isolated and after appropriate experimental procedures(polymerase chain reaction - PCR, purification of PCR products), we searchedfor mutations in p53 gene exons 5, 6, 7 and 8 and in fas gene exon 9, bysingle strand conformation polymorphism (SSCP) and by direct sequencing.Moreover, in selected samples, RNA isolation was performed, followed by RTPCR,as to evaluate Fas receptor mRNA expression.Finally, p53, Fas, FADD, FLIP, pre-caspase 8 and caspase 8 proteinsexpression, was assessed by the immunohistochemical technique.Results Of the 40 thyroid carcinomas studied for mutations, one mutation wasdetected in exon 6 of the p53 gene in an anaplastic carcinoma. Allremaining samples were normal in both p53 and fas genes. RT-PCR analysis in total RNA thyroid carcinoma samples revealed thatthe predominant form of the Fas gene mRNA is the one that includesthe hydrophobic transmembrane unit and it is present in all samplestested. On the other hand, soluble Fas, is either not detected or isindeed present but at very low levels. Immunohistochemical analysis of thyroid carcinomas showed strongand increased expression of Fas receptor in almost all samples tested.In contrast, nuclear staining for the p53 protein was detected only in ananaplastic carcinoma, which carries the mutation in exon 6. The FADD protein was studied in 19 papillary and 2 follicular thyroidcarcinomas and revealed its presence in all samples. Proteins FLIP, pre-caspase 8 and caspase 8 were studied in 50 thyroidcarcinomas. Positive immunoreactivity for FLIP was performed in atotal of 35 samples, 39 samples were positive for pro-caspase 8protein, while 20 carcinomas exhibited immunopositivity for caspase 8. ConclusionsIt has already been shown experimentally that the thyroid cancer cells havedeveloped a resistance to receptor Fas mediated apoptosis. In this study, werevealed the structural integrity of p53 protein that activates, inter alia, theexpression of the Fas receptor, and the overexpression of the receptor itself inthyroid cancer cells. Furthermore, the presence of all key proteins involved inthe pathway (FADD, FLIP, pro-caspase 8 and caspase 8) in thyroidcarcinomas, indicate that the observed resistance, cannot be due to disruptionof the normal expression of the components of the Fas receptor apoptoticpathway.

ΕισαγωγήΗ ρύθμιση της απόπτωσης αποτελεί εξαιρετικής σημασίας διαδικασία για τηνανάπτυξη και διατήρηση πολυκύτταρων οργανισμών. Ιδιαίτερο ενδιαφέρονπαρουσιάζει η μελέτη της απόπτωσης σε κακοήθεις νεοπλασίες.Το γνωστό ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 έχει βρεθεί να επάγει τηναπόπτωση σε περίπτωση κυτταρικής βλάβης, ενεργοποιώντας μονοπάτιαπου προκαλούν το θάνατο του κυττάρου. Ανάμεσα στα μονοπάτια αυτάπεριλαμβάνεται και εκείνο του διαμεμβρανικού υποδοχέα Fas. Το γονίδιο fasφαίνεται λοιπόν να αποτελεί έναν από τους στόχους της δράσης τηςπρωτεΐνης p53.Ο υποδοχέας Fas, μέλος της οικογένειας των υποδοχέων Tumor NecrosisFactor Receptor (TNFR), αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα υποδοχέα πουπροκαλεί απόπτωση, όταν ενεργοποιηθεί από κατάλληλα ερεθίσματα. Τοαποπτωτικό αποτέλεσμα είναι η κατάληξη μιας αλληλουχίας συμβάντων,ενεργοποιήσεων μορίων και αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών που επισυμβαίνουνστο εσωτερικό του κυττάρου. Με την ενεργοποίηση του υποδοχέα Fas,σχηματίζεται ένα σύμπλοκο (σύμπλοκο DISC) με τη συμμετοχή τουκυτταροπλασματικού άκρου του υποδοχέα και των πρωτεϊνών FADD, FLIPκαι του προ-ενζύμου προ-κασπάση 8. Η ενσωμάτωση μορίων προ-κασπάσης-8 στο σύμπλοκο DISC ουσιαστικά ενεργοποιεί την κασπάση 8, ηοποία με τη σειρά της ενεργοποιεί άλλες πρωτεάσες. Δημιουργείται έτσι ένας«καταρράκτης» αλλεπάλληλων γεγονότων ενεργοποίησης κασπασών πουτελικά προκαλούν τον κυτταρικό θάνατο, όπως άλλωστε είναι και τοζητούμενο της απόπτωσης. ΣκοπόςΣκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη των γονιδίωνp53 και fas σε επίπεδο DNA, η διερεύνηση έκφρασης του υποδοχέα Fas σεμεταγραφικό επίπεδο ως προς την παρουσία της υδρόφοβης διαμεμβρανικήςυπομονάδας, η μελέτη των συστατικών στοιχείων του αποπτωτικούμονοπατιού του υποδοχέα Fas σε επίπεδο πρωτεϊνών και η αναζήτηση πιθανής εξήγησης της ανθεκτικότητας των θυρεοειδικών θυλακιοκυτταρικώνκαρκινικών κυττάρων προς αυτό το μονοπάτι, μέσω ενδεχόμενης απουσίαςέκφρασης ενός συστατικού στοιχείου.Υλικό και μέθοδοιΤο υλικό που συγκεντρώθηκε και μελετήθηκε στην παρούσα διδακτορικήδιατριβή, προέκυψε μετά από αναζήτηση στα αρχεία του Α’ ΕργαστηρίουΠαθολογικής Κλινικής της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και ΚαποδιστριακούΠανεπιστημίου Αθηνών. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε υλικό από συνολικά80 θυρεοειδικά ιστολογικά παρασκευάσματα (71 θηλώδη Ca, 2 θυλακιώδηCa, 2 αναπλαστικά Ca, 2 οξύφιλα (Hürthle) Ca, 2 μικτά Ca και έναςυπερπλαστικός όζος) που είχαν εξαιρεθεί χειρουργικά, μονιμοποιηθεί σεφορμόλη και εγκλειστεί σε κύβους παραφίνης.Τα θυρεοειδικά παρασκευάσματα που συλλέχθηκαν, μελετήθηκαν σε τρίαδιαφορετικά επίπεδα: σε επίπεδο DNA, RNA και πρωτεϊνών.Αρχικά, πραγματοποιήθηκε απομόνωση DNA και έπειτα από κατάλληλες πειραματικές διεργασίες (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης - PCR,καθαρισμός προϊόντων PCR), αναζητήθηκε διεξοδικά η πιθανή παρουσίαμεταλλαγών στα εξώνια 5, 6, 7 και 8 του γονιδίου p53 και του εξωνίου 9 τουγονιδίου fas, με τις τεχνικές ανάλυσης πολυμορφισμών διαμόρφωσηςπρωτοταγούς αλυσίδας (SSCP) και ανάλυσης πρωτοταγούς δομής DNA(sequencing).Παράλληλα, σε επιλεγμένα θυρεοειδικά δείγματα πραγματοποιήθηκεαπομόνωση RNA και παρασκευή cDNA, με σκοπό τη μελέτη έκφρασηςmRNA του υποδοχέα Fas, με την τεχνική της αντίστροφης μεταγραφής –αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR).Τέλος, η ιστική εντόπιση και η ημιποσοτική αξιολόγηση της έκφρασης τωνπρωτεϊνών p53, Fas, FADD, FLIP, προ-κασπάση 8 και κασπάση 8πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της ανοσοϊστοχημείας. Αποτελέσματα Από τις συνολικά 40 περιπτώσεις θυρεοειδικών καρκινωμάτων πουμελετήθηκαν σε επίπεδο DNA, ανιχνεύθηκε μια μεταλλαγή στο εξώνιο 6του γονιδίου p53 σε ένα αναπλαστικό καρκίνωμα. Όλα τα υπόλοιπα δείγματα ήταν φυσιολογικά τόσο στο γονίδιο p53 όσο και στο γονίδιοfas. Από τ η ν α ν ά λ υ σ η μ ε τ η ν τ ε χ νι κ ή RT-PCR σ ε δ ε ί γ μ α τ α ο λ ι κ ο ύRNA θ υ ρ ε ο ε ι δ ι κών κ α ρ κ ι νωμ ά των πρ ο έ κ υψε πως ηεπι κ ρ α τ ο ύ σ α μ ο ρφ ή mRNA τ ο υ γ ο νι δ ί ο υ Fas ε ί να ι ε κ ε ί νηπο υ πε ρ ι λ α μ β ά νε ι τ η ν υ δ ρ ό φο β η δ ι α μ ε μ β ρ α νι κ ή μ ο νά δ α κ α ιπα ρ ά λ λ η λ α ε ί να ι πα ρ ο ύ σ α σ ε ό λ α τ α δ ε ί γ μ α τ α πο υμ ε λ ε τ ή θ η κ α ν. Α ντ ί θ ε τ α , η ε να λ λ α κ τ ι κ ή μ ο ρφή τ ο υ δ ι α λ υ το ύFas, ε ί τ ε δ ε ν α νι χ ν ε ύ ε τ α ι κ α θ ό λ ο υ , ε ί τ ε ε ί να ι πα ρ ο ύ σ α α λ λ άσ ε ι δ ι α ί τ ε ρ α χα μ η λ ά επί πε δ α . Η α νο σ ο ϊ σ τ ο χη μ ι κ ή α νά λ υ σ η των θ υ ρ ε ο ε ι δ ι κώνκ α ρ κ ι νωμ ά τ ων απ ο κ ά λ υψε ι σ χυ ρ ή α υ ξ η μ έ νη έ κφρ α σ η τ ο υυπο δ ο χέ α Fas σ χε δ ό ν σ τ ο σ ύ ν ο λ ο των δ ε ι γ μ ά τωνε ξ ε τ ά σ τ η κ α ν. Α ντ ί θ ε τ α , πυ ρ η νι κ ή χρώσ η γ ι α τ η ν πρωτ ε ΐ νηp53 ε ντ οπί σ τ η κ ε μ ο νά χα σ ε έ να α ν α πλ α σ τ ι κ ό κ α ρ κ ί νωμ α ,πο υ φ έ ρ ε ι τ η μ ε τ α λ λ α γ ή σ τ ο ε ξώνι ο 6 . Η πρωτ ε ΐ νη FADD μ ε λ ε τ ή θ η κ ε σ ε 1 9 θ η λώδ η κ α ι 2θ υ λ α κ ιώδ η κ α ρ κ ι νώμ α τ α κ α ι α πο κ ά λ υψε τ η ν πα ρ ο υ σ ί α τ η ςσ ε ό λ α τ α δ ε ί γ μ α τ α . Οι πρωτ ε ΐ νε ς FLIP, πρ ο -κ α σπά σ η 8 κ α ι κ α σπά σ η 8μ ε λ ε τ ή θ η κ α ν σ ε 5 0 θ υ ρ ε ο ε ι δ ι κ ά κ α ρ κ ι νώμ α τ α . Θε τ ι κ ήα νο σ ο α ντ ί δ ρ α σ η γ ι α τ η ν FLIP έ δ ε ι ξ α ν 3 5 σ υ νο λ ι κ ά δ ε ί γ μ α τ α ,γ ι α τ η ν π ρ ο - κ α σπ ά σ η 8 έ δ ε ι ξ α ν 3 9 δ ε ί γ μ α τ α , ε νώ τ έ λ ο ς ηκ α σπά σ η 8 ε μ φ ά νι σ ε α νο σ ο θ ε τ ι κ ό τ η τ α σ ε 2 0 κ α ρ κ ι νώμ α τ α .Σ υμπερ άσμ ατ αΈχε ι δ ε ι χθ ε ί ή δ η πε ι ρ α μ α τ ι κ ά πως τ α θ υ ρ ε ο ε ι δ ι κ άθ υ λ α κ ι ο κ υ τ τ α ρ ι κ ά κ α ρ κ ι νι κ ά κ ύ τ τ α ρ α έ χο υ ν α να πτ ύ ξ ε ι μ ι αα νθ ε κ τ ι κ ό τ η τ α σ τ η ν απόπτωσ η μ έ σω τ ο υ υπο δ ο χέ α Fas. Η μ ε λ έ τ ηπο υ πρ α γ μ α τ ο πο ι ή σ α μ ε απο κ ά λ υ ψε τ η δ ο μ ι κ ή α κ ε ρ α ι ό τ η τ α τ η ςπρωτ ε ΐ νη ς p53 πο υ ε νε ρ γ οπο ι ε ί , μ ε τ α ξ ύ ά λ λων , τ η ν έ κ φρ α σ η τ ο υυπο δ ο χέ α Fas, κ α θώς κ α ι τ η ν υ π ε ρ έ κφρ α σ η τ ο υ ί δ ι ο υ τ ο υυπο δ ο χέ α σ τ α θ υ ρ ε ο ε ι δ ι κ ά κ α ρ κ ι νι κ ά κ ύ τ τ α ρ α . Επι πλ έ ο ν,δ ι απι σ τώθ η κ ε η π α ρ ο υ σ ί α ό λων των β α σ ι κών πρωτ ε ϊ νών πο υ σ υ μ μ ε τ έ χο υ ν σ τ ο μ ο νο πά τ ι (FADD, FLIP, πρ ο -κ α σπ ά σ η 8 κ α ικ α σπά σ η 8 ). Τ ο πα ρ απά νω γ ε γ ο νό ς υπο δ ε ι κ νύ ε ι πως ηπα ρ α τ η ρ ο ύ μ ε νη α νθ ε κ τ ι κ ό τ η τ α , δ ε ν μπο ρ ε ί να ο φε ί λ ε τ α ι σ εδ ι α τ α ρ α χή τ η ς φυ σ ι ο λ ο γ ι κ ή ς έ κφ ρ α σ η ς των σ υ σ τ α τ ι κών σ τ ο ι χε ίωντ ο υ αποπτωτ ι κ ο ύ μ ο νο πα τ ι ο ύ τ ο υ υπο δ ο χέ α Fas.