Structural studies of the oncoproteins c-Myc and PI3Kα and development of new synthetic molecules inhibiting their function

Abstract

The MYC oncogene is at the crossroads of many important biological pathways and processes involved in neoplastic cell growth and proliferation. MYC is documented to be involved broadly in many cancers, in which its expression is estimated to be elevated or deregulated in up to 70% of human malignancies. Tumors with elevated MYC expression often exhibit highly proliferative, aggressive phenotypes. Despite our ever-growing understanding of MYC biology, currently no targeted therapeutic strategy is clinically available to treat tumors that have acquired elevated MYC expression. Detailed knowledge of protein structure is imperative for understanding mechanistic aspects of its function. However, intrinsically disordered proteins like c-Myc, under native conditions assume a wide range of structurally unrelated conformations, thus rendering the study of their structure quite challenging. Since no structure has been suggested for the c-Myc monomer so far, we tried to address the difficult task of proposing a possible set of structures for the c-Myc monomer through a series of advanced NMR experiments and CD spectroscopy, each of which provides a different type of structural information, most of which were utilized as restraints in structural calculations. Collectively, our experimental and computational data agree that the Leucine Zipper (LZ) of c-Myc is preconfigured prior to Max binding and may project the adjacent unfolded chain in the appropriate direction to achieve a “fly casting” interaction with Max. In contrast, the basic helix-loop-helix region is completely disordered, suggesting that it may not have a direct role in the initiation of hetero-dimerization. Remarkably, a stretch of about 23 amino acids in the LZ region is firmly pre-configured to an α-helix. Notably, that region of c-Myc was believed to interact with a 9-mer peptide derived from the LZ of Max that can impair the transcriptional activity of c-Myc in vivo. Using a combined experimental (NMR, CD) and Metadynamics approach, we tried to investigate in more detail the structural dynamics if these important peptides. Our findings suggest that the 23mer peptide retains the helical structure of the LZ but kinked in the middle. In contrast the 9mer peptide is completely disordered. Moreover the two peptides don’t interact, according to our NMR and CD measurements. A valuable approach to halt MYC protein on the path to cancer is to interrupt the interaction with its co-activator MAX. Since c-Myc monomer retains minimal pre-configure structure, we employed a combination of ligand-based drug design calculations based on knowledge of known inhibitors with the aim to discover new selective c-Myc/Max dimerization inhibitors. From the 34 candidate molecules that we tested through microscale thermophoresis (MST) and surface plasmon resonance (SPR), one had micromolar dissociation constant (Kd), quite close to the Kd of Max protein. That molecule is being undergoing currently cell viability measurements on a variety of cancer cell lines that over-express c-Myc, as well as evaluation of ADME-Tox properties and cancer therapeutic potential in mice bearing c-Myc induced tumors.Effective cancer therapy necessitates multi-level targeting of oncoproteins. Since there is a cross-talk between c-Myc/Max and PI3Kα mediated pathways, we also tried to design in silico PI3Kα inhibitors. First the conformational plasticity of the wild type and the oncogenic H1047R PI3Kα mutant in complex with PIK-108 inhibitor was studied through accelerated molecular dynamics simulations and free energy calculations. However, no significant differences were found between the two protein variants. Notwithstanding, representative conformations were utilized to screen in silico chemical libraries. This virtual exercise resulted in the discovery of two potent PI3Kα inhibitors, as suggested by both cell-based and cell-free binding assays.

Το ογκογονίδιο MYC βρίσκεται στο σταυροδρόμι πολλών σημαντικών βιολογικών μονοπατιών που εμπλέκονται στην νεοπλασματική κυτταρική αύξηση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Το MYC εμπλέκεται ευρέως σε πολλούς τύπους καρκίνου, όπου μάλιστα υπολογίζεται ότι η έκφραση του είναι αυξημένη ή απορυθμισμένη έως και 70%. Οι όγκοι με αυξημένη έκφραση του MYC συχνά παρουσιάζουν επιθετικούς φαινοτύπους. Παρά την ολοένα αυξανόμενη κατανόηση της βιολογίας του MYC, προς το παρόν δεν υπάρχει κλινικά διαθέσιμη στοχευμένη θεραπεία των όγκων που έχουν αποκτήσει αυξημένη έκφρασή του. Η λεπτομερής γνώση της δομής μιας πρωτεΐνης είναι επιτακτική ανάγκη για την κατανόηση της μηχανικής και της λειτουργίας της. Ωστόσο, εγγενώς αδιάτακτες πρωτεΐνες όπως η c-Myc, υπό φυσικές συνθήκες λαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα δομικά άσχετων διαμορφώσεων, καθιστώντας έτσι τη μελέτη της δομής τους αρκετά πολύπλοκη. Δεδομένου ότι δενέχει προταθεί δομή για το μονομερές c-Myc μέχρι στιγμής, προσπαθήσαμε να προτείνουμε ένα δυνατό σύνολο δομών διαμέσου μιας σειράς προηγμένων πειραμάτων NMR και φασματοσκοπίας CD. Καθένα από αυτά παρέχει διαφοτερικού τύπου δομική πληροφορία, η οποία χρησιμοποιήθηκε ως περιορισμός κατά την διάρκεια των δομικών υπολογισμών. Συλλογικά, τα πειραματικά και τα υπολογιστικά δεδομένα μας συμφωνούν ότι το φερμουάρ λευκίνης (LZ) του c-Myc είναι προδιατεταγμένοπριν από την δέσμευση στο Max και μπορεί να προβάλει την παρακείμενη αδιάτακτη αλυσίδα στην κατάλληλη κατεύθυνση ώστε να επιτευχθεί ισχυρότερη αλληλεπίδραση με το Max. Σε αντίθεση, η βασική περιοχή έλικας-βρόχου-έλικας (BHLH) είναι εντελώς αδιάτακτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν μπορεί να έχει άμεσο ρόλο στην έναρξη του ετεροδιμερισμού. Μάλιστα, μια έκταση 23 αμινοξέων στην περιοχή LZ είναι καλά προδιατεταγμένη σε α-έλικα. Αξίζει να σημειωθεί, ότι αυτή η περιοχή του c-Myc πιστεύετο ότι αλληλεπιδρά με ένα 9-μερές πεπτίδιο που προέρχεται από την LZ του Max, το οποίο μπορεί να βλάψει την μεταγραφική δραστικότητα της c-Myc in vivo. Χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό πειραμάτων (NMR, CD) και προσομοιώσεων μεταδυναμικής (metadynamics), προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε λεπτομερέστερα τη δυναμική αυτών των σημαντικών πεπτιδίων. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το 23μερές πεπτίδιο διατηρεί την ελικοειδή δομή του LZ αλλά λυγισμένη στη μέση. Σε αντιπαραβολή, το 9μερές πεπτίδιο είναι εντελώς αδιάτακτο. Επιπλέον, τα δύο πεπτίδια δεν αλληλεπιδρούν, σύμφωνα με τις NMR και CD μετρήσεις μας. Μια βασική προϋπόθεση για να σταματήσει η πορεία της c-Myc πρωτεΐνης προς τον καρκίνο είναι να διακοπεί η αλληλεπίδραση με τον συν-ενεργοποιητή της, Max. Επειδή το μονομερές c-Myc διατηρεί ελάχιστη δομή, χρησιμοποιήσαμε ένα συνδυασμό υπολογισμών σχεδιασμού φαρμάκων βάση ομοιότητας σε γνωστούς προσδέτες (ligand-based drug design), οι οποίοι βασίζονται στη γνώση γνωστών αναστολέων με στόχο την ανακάληψη νέων επιλεκτικών αναστολέων του διμερισμού c-Myc/Max. Από τα 34 υποψήφια μόριαπου παραγγείλαμε και δοκιμάσαμε πειραματικά μέσω των τεχνικών microscale thermophoresis (MST) και surface plasmon resonance (SPR), ένα είχε σταθερά διάστασης (Kd) αρκετά κοντά στη Kd της Max πρωτεΐνης (1 μΜ), η οποία είναι ο φυσικός προσδέτης της c-Myc. Αυτό το μόριο βρέθηκε ότι έχει επίσης αυξημένη κυτταροτοξικότητα σε μια ποικιλία καρκινικών κυτταρικών σειρών που υπερεκφράζουν το c-Myc και πλέον υποβάλεται σε μετρήσεις ιδιοτήτων απορρόφησης, κατανομής, μεταβολισμού και απέκκρισης (ADME) σε ποντίκια που φέρουν c-Myc προκαλούμενους όγκους. Η αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου απαιτεί πολυεπίπεδη στόχευση ογκοπρωτεϊνών. Δεδομένου ότι υπάρχειμια διασύνδεση μεταξύ c-Myc/Max και PI3Kα διαμέσου διασταυρούμενων μονοπατιών, προσπαθήσαμε επίσης να σχεδιάσουμε in silico PI3Kα αναστολείς. Πρώτα μελετήθηκε η δυναμική της άγριου τύπου PI3Kα καθώς και της πρωτεΐνης με τη μετάλλαξη H1047R σε σύμπλοκο μετον αναστολέα PIK-108 διαμέσου προσομοιώσεων επιταχυνόμενης μοριακής δυναμικής (accelerated molecular dynamics) και υπολογισμών ελεύθερης ενέργειας (free energy calculations). Ωστόσο, δεν βρέθηκαν σημαντικές σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο παραλλαγών της πρωτεΐνης. Παρόλα αυτά, αντιπροσωπευτικές διαμορφώσεις από τις μοριακές τροχιές (trajectories) χρησιμοποιήθηκαν για σάρωση in silico χημικών βιβλιοθήκων. Αυτή η εικονική διαδικασία οδήγησε στην ανακάλυψη δύοισχυρών αναστολέων της PI3Kα (με IC50 2.9 και 11.7 μΜ αντίστοιχα), σύμφωνα με τα in vitro πειράματα πρόσδεσης καθώς και τα κυτταρικά πειράματα.