Μελέτη της γενετικής βάσης της αναιμίας Diamond-Blackfan και του συνδρόμου Shwachman-Diamond στον ελληνικό πληθυσμό

Abstract

Introduction: Diamond Blackfan Anemia (DBA) and Shwachman Diamond Syndrome (SDS) are inherited bone marrow failure syndromes. DBA is a rare ribosomopathy characterized by normochromic macrocytic anemia, reticulocytopenia and absence or insufficiency of erythroid precursors in normocellular bone marrow, frequently associated with somatic malformations. Mutations in ribosomal genes account for 60% to 70% of DBA cases. Shwachman-Diamond syndrome (SDS) is an inherited neutropenia syndrome associated with a significant risk of aplastic anemia and malignant transformation. Multiple additional organ systems, including the pancreas, liver, and skeletal and central nervous systems, are affected. Mutations in the Shwachman-Bodian-Diamond syndrome (SBDS) gene are present in most patients. Seventy five per cent of the causative mutations concern gene recombination events between SBDS gene and SBDSP pseudogene on chromosome 7. This study presents findings from 18 patients recorded in the Greek DBA registry and from eleven patients recorded in the Greek SDS registry. Methods: Clinical evaluation of patients and data collection was performed followed by the molecular analysis of RPS19, RPL5, and RPL11 genes for DBA and SBDS gene for SDS. Mutation detection included PCR amplification, ECMA analysis, RFLPs and direct sequencing. To elucidate cis/ trans configuration of mutations on the SBDS gene double digestion with both AciI and Bsu36I was performed. Restriction Fragment Length Polymorphism assays with Bsu36I and AciI allowed detection of the two most common mutations (c.183-184 TA>CT and 258+2T>C).Results:DBACongenital anomalies were observed in 72% of the DBA patients. Three patients (17%) were found to carry mutations on the RPS19 gene, three patients (17%) on the RPL5 gene and one patient (6%) on the RPL11 gene . Mutations c.C390G (p.Y130X) and c.197_198insA (p.Y66X) detected in the RPL5 gene were novel.SDSExtreme clinical heterogeneity was documented and was attributed to both mosaicism and allelic expression. The most severely affected patient in our registry was diagnosed at birth and it is the first ever reported patient that required bone marrow transplantation so early in life. Severe psoriasis, a feature not previously reported in SDS, was observed in one patient. Mutations in SBDS gene were found in all patients. Cytogenetic analyses revealed two patients with, clonal abnormalities, one of which was novel. Discussion: The clinical course both of DBA and SDS patients was similar to previous reports. The occurrence of thyroid carcinoma in an adult patient with DBA is the first to be reported in DBA. Also the results of our data support that SDS mode of inheritance can be very complex, mostly because of complicated gene conversions events. Mosaicism appears not to be rare in SDS and should be considered, especially in cases with clinical heterogeneity in the presence of similar genotypes.

Εισαγωγή: Τόσο η Αναιμία Diamond Blackfan (DBA) όσο και το σύνδρομο Shwachman Diamond (SDS) ανήκουν στα σύνδρομα κληρονομούμενης μυελικής ανεπάρκειας. Η DBA είναι μια σπάνια ριβοσωμοπάθεια που χαρακτηρίζεται από νορμόχρωμη μακροκυπαρική αναιμία, δικτυοερυθροπενία, απουσία ή υποπλασία των πρόδρομων μορφών της ερυθράς σειράς σε νορμοκυτταρικό μυελό των οστών και παρουσία συγγενών ανωμαλιών. Στο 60-70% των περιπτώσεων ανιχνεύονται μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν ριβοσωμικές πρωτείνες. Στο σύνδρομο Shwachman-Diamond (SDS) παρατηρείται κυρίως ουδετεροπενία και σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης απλαστικής αναιμίας και κακοήθους εξαλλαγής. Επιπλέον εμφανίζονται διαταραχές από πολλαπλά όργανα, περιλαμβανομένων του παγκρέατος, του ήπατος, του σκελετικού και κεντρικού νευρικού συστήματος. Στους περισσότερους ασθενείς ανιχνεύονται μεταλλάξεις στο Shwachman-Bodian-Diamond γονίδιο (SBDS). Το 75% των μεταλλάξεων είναι αποτέλεσμα της γονιδιακής μετατροπής που συμβαίνει μεταξύ του SBDS γονιδίου και του SBDSP ψευδογονιδίου του, στο χρωμόσωμα 7. Η παρούσα μελέτη παρουσιάζει ευρήματα από 18 και 11 αντίστοιχα ασθενείς που καταγράφονται στα ελληνικά μητρώα DBA και SDS .Μέθοδοι: Αρχικά έγινε η κλινική αξιολόγηση των ασθενών και η συλλογή των δεδομένων και στη συνέχεια ακολούθησε μοριακή ανάλυση των RPS19, RPL5 και RPL11 γονιδίων για την DBA και του SBDS γονιδίου για το SDS. Για την ανίχνευση των μεταλλάξεων χρησιμοποιήθηκαν η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR), η τεχνική ECMA (Enzymatic Cleavage Mismatch analysis), τα περιοριοριστικά ένζυμα (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLPs) καθώς και η αλληλούχηση της πρωτοταγούς δομής του DNA (sequencing). Για να αποδείξουμε ότι οι μεταλλάξεις στο SBDS είναι στο ίδιο ή σε διαφορετικό αλληλόμορφο (cis / trans) σχεδιάστηκε πρωτόκολλο περιοριστικών ενζύμων με διπλή πέψη από τα AciI και Bsu36I ένζυμα. Η ανίχνευση των δυο συχνότερων μεταλλάξεων στο SBDS γονίδιο έγινε με την βοήθεια των Bsu36I και AciI ενζύμων που ανιχνεύουν τις c.183-184 TA> CT και 258 + 2Τ> C αντίστοιχα.Αποτελέσματα:DBAΣτο 72% των ασθενών με DBA παρατηρήθηκαν συγγενείς ανωμαλίες. Σε τρεις ασθενείς (17%) ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις στο γονίδιο RPS19, σε τρεις ασθενείς (17%) στο γονίδιο RPL5 και σε έναν ασθενής (6%) στο γονίδιο RPL11. Οι c.C390G (p.Y130X) και c.197_198insA (p.Y66X) μεταλλάξεις που ανιχνεύθηκαν στο γονίδιο RPL5 αναφέρονται για πρώτη φορά.SDSΜεγάλη κλινική ετερογένεια καταγράφηκε και στο δικό μας αρχείο και αποδόθηκε τόσο στο μωσαϊκισμό όσο και στο ποσοστό έκφρασης των αλληλομόρφων. Αξιοσημείωτο είναι ένας από τους ασθενείς μας που καταγράφηκε στο Αρχείο ο οποίος διεγνώστη κατά την γέννηση λόγω των σοβαρών αιματολογικών συμπτωμάτων του. Αυτή η ασθενής υποβλήθηκε σε μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων πολύ νωρίς σε ηλικία 12 μηνών και είναι η πρώτη φορά που αναφέρεται μεταμόσχευση σε ασθενή με SDS τόσο νωρίς κατά την παιδική ηλικία. Σοβαρή ψωρίαση καταγράφηκε για πρώτη φορά σε έναν ασθενή μας με SDS. Μεταλλάξεις στο SBDS γονίδιο ανιχνεύθηκαν σε όλους τους ασθενείς. Η κυτταρογενετική ανάλυση αποκάλυψε κλωνικές ανωμαλίες σε δύο ασθενείς, η μία εκ των οποίων αναφέρεται για πρώτη φορά.Συζήτηση: Η κλινική πορεία των ασθενών τόσο με DBA όσο και με SDS ήταν παρόμοια με προηγούμενες αναφορές. Η εμφάνιση καρκίνου θυρεοειδούς σε έναν ενήλικα ασθενή με DBA αναφέρεται για πρώτη φορά. Επίσης τα αποτελέσματα στο SDS υποστηρίζουν ότι οι τρόποι κληρονομικότητας στο SDS μπορεί να είναι περίπλοκοι, κυρίως λόγω φαινομένων γονιδιακής μετατροπής. Ο μωσαικισμός δεν φαίνεται να είναι σπάνιος στο SDS σύνδρομο και πρέπει να ελέγχεται, ιδιαίτερα στις περιπτώσεις με ίδιο γονότυπο αλλά με μεγάλη κλινική ετερογένεια.