Η επίδραση του οξειδίου του αζώτου (ΝΟ) και του υδροθείου (H2S) στον εγκλιματισμό σπορόφυτων νεραντζιάς (Citrus aurantium L.) σε συνθήκες ξηρασίας

Abstract

Nitrosative status has emerged as a key component in plant response to abiotic stress, however, knowledge on its regulation by different environmental conditions remains unclear. In plants, experimental data justify the role of NO as an intercellular signaling molecule under abiotic stress conditions, but data concerning H2S are scarce. The current study focused initially on nitrosative responses in citrus plants exposed to six abiotic stresses using physiological and molecular approaches. Phenotypical observations and molecular analysis showed that abiotic stress treatments were sensed by citrus plants. Furthermore, it was revealed that nitrosative networks are activated by environmental stress factors in citrus leaves as evidenced by increased nitrite content along with the release of NO and superoxide anion (O2-●) in the vascular tissues. The expression of genes potentially involved in NO production, was affected by the abiotic stress treatments demonstrating that NO-derived nitrosative responses could be regulated by various pathways. In addition, GSNOR and NR gene expression and enzymatic activity displayed significant changes in response to adverse environmental conditions, particularly cold stress. The type of abiotic treatment modified differently the ONOO- scavenging ability of citrus plants as well as the protein nitration levels and the protein S-nitrosylation patterns. In a second experiment the effect of SNP and NaHS in the acclimation of citrus plants to drought stress (induced by PEG) was investigated. The roots of citrus plants were pretreated with SNP or NaHS and afterwards exposed to PEG treatments for 21 days. Phenotypical observations and molecular analysis showed that both pre-treatments induced the acclimation of citrus plants to PEG-derived drought stress. Under drought stress the portions of nitrite and NOx were increased, but decreased under SNP or NaHS pre-treatment. Under drought stress, total RSNOs levels were modified and a significant modulation in GSNOR activity was observed following both pre-treatments. The activity of LCD was changed under drought condition, whereas H2S level was changed by both pre-treatments under drought. Several changes in carbonylation and nitration levels were recorded in plant pre-treated with SNP or NaHS. Also, NO or H2S, caused an increase in S-nitrosylation levels under water stress. Following mass spectrometry analysis 33 S-nitrosylated proteins were identified which mainly are involved in photosynthesis, photorespiration and abiotic defense. Also, via proteomic analysis several different protein patterns were observed among treatments, providing clues for specific protein alternations driven by drought, SNP or H2S. These results suggest that the nitrosative response of citrus plants is differentially regulated depending on the stress type and underscore the possible role of GSNOR as a potent molecular marker of cold stress in citrus. Overall these data support the existence of an interaction among NO and H2S during the acclimation of citrus plants to drought stress.

Η γνώση των επιπέδων των ενεργών μορφών αζώτου (RNS) αποτελεί κλειδί στη μελέτη των αβιοτικών καταπονήσεων. Πτυχές του μηχανισμούς δράσης των RNS κατά την διάρκεια των τελευταίων ετών δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως. Στα φυτά, πειραματικά δεδομένα τεκμηριώνουν τον ρόλο του ΝΟ ως ενδοκυτταρικού χημικού αγγελιοφόρου, ενώ ο ρόλος του H2S είναι υπό διερεύνηση. Η παρούσα εργασία μελετά αρχικά τις αποκρίσεις φυτών νεραντζιάς (Citrus aurantium L.) ως προς τα επίπεδα μεταβολής των RNS έπειτα από την έκθεση των φυτών σε έξι αβιοτικές καταπονήσεις. Με ανατομικές, μοριακές, βιοχημικές μετρήσεις, διαπιστώθηκε ότι οι αβιοτικές καταπονήσεις οδήγησαν στην αύξηση της συγκέντρωσης των NO2-, με παράλληλη απελευθέρωση ΝΟ και Ο2-● στον αγωγό ιστό. Επίσης, οι διάφορες αβιοτικές καταπονήσεις μετέβαλαν την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την παραγωγή του ΝΟ. Σε συνθήκες ψύχους, η έκφραση του γονιδίου αλλά και η δράση του ενζύμου της GSNOR αλλά και της NR μεταβλήθηκε. Επίσης οι αβιοτικές καταπονήσεις επηρέασαν την ικανότητα εκκαθάρισης του ΟΝΟΟ-. Τα επίπεδα της νίτρωσης και της S-νιτροσυλίωσης των πρωτεϊνών μεταβλήθηκαν μεταξύ των αβιοτικών καταπονήσεων. Στη συνέχεια o πειραματισμός επικεντρώθηκε στην προσπάθεια επαγωγής του εγκλιματισμού των φυτών με την προ-μεταχείρισή τους με ΝΟ ή H2S. Ανατομικές, μοριακές, βιοχημικές μετρήσεις κατέδειξαν την θετική απόκριση των φυτών στην προ-μεταχείριση με ΝΟ ή H2S. Η ποσότητα των NO2- και ΝΟx αυξήθηκε σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης, ενώ μειώθηκε στις προ-μεταχειρίσεις με ΝΟ ή H2S. Σε συνθήκες ξηρασίας παρατηρήθηκε μεταβολή στην συγκέντρωσης των ολικών RSNO και σημαντική τροποποίηση της δράσης της GSNOR όταν τα φυτά επωάστηκαν σε διαλύματα ΝΟ ή H2S. Σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης, επηρεάστηκε η δράση της LCD και διαπιστώθηκε τροποποίηση της συγκέντρωσης H2S, όταν τα φυτά προ-μεταχειρίστηκαν με ΝΟ ή H2S. Η γονιδιακή έκφραση της NR, σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης παρέμεινε στα επίπεδα του μάρτυρα όταν τα φυτά προ-μεταχειρίστηκαν με ΝΟ ή H2S. Επίσης, σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης, μειώθηκε η καρβονυλίωση και η νίτρωση των πρωτεϊνών όταν στα φυτά προ-μεταχειρίστηκαν με ΝΟ ή H2S. Επίσης, η προ-μεταχείριση με ΝΟ ή με H2S αύξησε την S-νιτροσυλίωση. Η ανάλυση των S-νιτροσυλιωμένων πρωτεϊνών έδειξε ότι 33 πρωτεΐνες S-νιτροσυλιώθηκαν, οι οποίες στη συνέχεια διαπιστώθηκε ότι εμπλέκονται κυρίως στη φωτοσύνθεση. Επίσης, με ανάλυση του πρωτεϊνικού χάρτη στα φύλλα εντοπίστηκαν οι πρωτεϊνικές μεταβολές ως προς την υδατική καταπόνηση και τις προ-μεταχειρίσεις με ΝΟ ή με H2S. Με βάση τα αποτελέσματα προτείνεται ότι το είδος της καταπόνησης καθορίζει τον τρόπο δράσης των RNS. Η GSNOR δύναται να αποτελέσει βιοχημικό δείκτη της καταπόνησης ψύχους στα εσπεριδοειδή. Σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης, τα πειραματικά δεδομένα τεκμηριώνουν την ύπαρξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των ΝΟ και H2S. Σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης, το ΝΟ και το H2S επιδρά σε εξειδικευμένους πρωτεϊνικούς στόχους, ενισχύοντας τον ρόλο των συγκεκριμένων βιομορίων στον εγκλιματισμό σε περιβαλλοντικές καταπονήσεις.