Ανατομική και ιστοχημική μελέτη ελληνικών φαρμακευτικών φυτών βιοδραστικές ουσίες και δυνατότητες αξιοποίησής τους

Abstract

A literature research on medicinal plants indicated that there are limited papers focused on the correlation on plants’ anatomical characteristics and biosynthesis of specific secondary metabolites with their pharmaceutical properties. There are fewer papers presenting the antimicrobial activities of Greek medicinal plants. For this reason, this study was based on a combination of anatomical, phytochemical and antimicrobial methods on common medicinal plants. Thirteen Greek plants which lacked detailed bibliography on anatomy, phytochemistry and bioactivity were chosen. The plants were: Cichorium spinosum L., Euphorbia characias subsp. veneta (Wild.) Litard., Ficus carica L., Globularia alypum L., Mandragora officinarum L., Osyris alba L., Phillyrea latifolia L., Pistacia lentiscus L. var Chia, Pistacia lentiscus L., Ricinus communis L., Vitex agnus - castus L.. This study focused on specific anatomical features, such as secretive trichomes, laticifers, resin ducks and idioblasts, mainly in the leaf but also in the petiole, stem and root. Additionally, the sub-cellular localization of secondary metabolites was checked by using histochemical reagents and in vitro cultures of plant cells (callus) were carried out. Seven out of the thirteen plants presented specific anatomical characteristics and a variety of secondary metabolites. Those plants were Euphorbia characias subsp. veneta (Wild.) Litard., Ficus carica L., Globularia alypum L., Mandragora officinarum L., Osyris alba L., Phillyrea latifolia L., Pistacia lentiscus L. var Chia, Pistacia lentiscus L., Ricinus communis L.. A phytochemical profile was carrying out by using ultra-high pressure liquid chromatography-MS (UHPLC-MS), gas chromatography–mass spectrometry (GC-MS) and gas chromatography flame ionization detector (FID). For the evergreen sclerophyllous plants, a comparative study on their major secondary metabolites during summer and winter was performed. Leaf extracts from these seven plants were checked for the existence of bioactive molecules with antimicrobial activity. SM. The antibacterial activity was evaluated by using the Agar Disc Diffusion Assay and Agar Well Diffusion Assay against ATCC (Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC29213, Pseudomonas aeruroginosa ATCC27853), clinical strains (S. aureus, P. aeuroginosa, Streptococcus sp, Candida albicans) and resistant strains of Methicillin-resistant S. aureus (MRSA), Carbapenem-Resistant Metallo-β-Lactamase (carbapenemase) P. aeruginosa (VIM), Klebsiella pneumonia carbapenemases (KPCs) and Acinetobacter baumanii resistant strains. This is the first study on medicinal plants which combines anatomical features, subcellular localization of secondary metabolites, phytochemical profile and antimicrobial activity. Moreover, callus induction on the medicinal plants F. carica and O. alba is reported for the first time.

Η ανασκόπηση της βιβλιογραφίας σε φαρμακευτικά φυτικά είδη οδήγησε στο συμπέρασμα ότι δεν υπάρχουν ολοκληρωμένες μελέτες οι οποίες να συνδέουν τις φαρμακευτικές ιδιότητες φυτικών ειδών με την βιοσύνθεση ή/και βιοσυσσώρευση μεταβολιτών σε συγκεκριμένες εκκριτικές δομές (αδενώδεις τρίχες, γαλακτοφόροι σωλήνες, ρητινοφόροι αγωγοί) και στη δράση ειδικών δευτερογενών μεταβολιτών που βιοσυνθέτουν τα φυτά. Σημαντικές είναι και οι ελλείψεις σε βιβλιογραφικά δεδομένα όσον αφορά στον έλεγχο αντιμικροβιακής δράσης Ελληνικών φαρμακευτικών φυτών. Οι δύο αυτές συνιστώσες προκάλεσαν τα ερωτήματα που προσπαθεί να διαφωτίσει η παρούσα Διδακτορική Διατριβή. Αντικείμενο της μελέτης ήταν η πρωτότυπη προσέγγιση του φύλλου, του μίσχου και σε ορισμένες περιπτώσεις του βλαστού και της ρίζας, επιλεγμένων Eλληνικών, φαρμακευτικών φυτικών ειδών. Η προσέγγιση αυτή αφορούσε τη συσχέτιση παρουσίας εκκριτικών δομών στο εκάστοτε φυτό, την ανίχνευση των βασικών δευτερογενών μεταβολιτών σε συγκεκριμένα εκχυλίσματα φύλλων αλλά και τον έλεγχο της παρουσίας βιοενεργών μορίων με αντιμικροβιακή δράση. Επιλέχθηκαν δέκα τρία φαρμακευτικά φυτικά είδη τα οποία αυτοφύονται στην Ελλάδα ή είναι επιγενή. Αυτά ήταν τα Cichorium spinosum L., Euphorbia characias subsp. veneta (Wild.) Litard., Ficus carica L., Globularia alypum L., Mandragora officinalis L., Osyris alba L., Phillyrea latifolia L., Pistacia lentiscus L. var Chia, Pistacia lentiscus L., Ricinus communis L., Vitex agnus-castus L.. Στα προαναφερθέντα φυτικά είδη πραγματοποιήθηκε λεπτομερής ανατομική μελέτη, σε νωπό και μονιμοποιημένο ιστό, με σκοπό τον εντοπισμό εκκριτικών σχηματισμών, ήτοι ιδιόβλαστων κυττάρων, εκκριτικών τριχών ή αδένων. Παράλληλα, επιχειρήθηκε υποκυτταρικός εντοπισμός των δευτερογενών μεταβολιτών που βιοσυντίθονται από τα φυτά με την χρήση ειδικών ιστοχημικών ανιχνευτών ενώ παράλληλα καλλιεργήθηκαν κύτταρα φύλλων in vitro σε συγκεκριμένα θρεπτικά υποστρώματα και, για κάποια από τα υπό μελέτη είδη, αναπτύχθηκαν μάζες φυτικών κυττάρων (κάλλοι). Από το σύνολο των δεκατριών αυτών φυτικών ειδών, εκκριτικές δομές και πλήθος δευτερογενών μεταβολιτών εντοπίστηκαν σε επτά: Euphorbia characias subsp. veneta (Wild.) Litard., Ficus carica L., Globularia alypum L., Mandragora officinarum L., Osyris alba L., Phillyrea latifolia L., Pistacia lentiscus L. var Chia, Pistacia lentiscus L., Ricinus communis L.. Τα φυτικά αυτά είδη μελετήθηκαν περαιτέρω ως προς το μεταβολικό τους προφίλ και την παρουσία βιοενεργών μορίων με αντιμικροβιακή δράση. Στο πειραματικό αυτό στάδιο συλλέχθηκαν εκχυλίσματα φύλλων (Accelerated Solvent Extractor system – A.S.E.) τα οποία μελετήθηκαν φυτοχημικά με αέρια χρωματογραφία συνδεδεμένη με φασματομετρία μάζας (GC/MS), αέρια χρωματογραφία συνδεδεμένη με ανιχνευτή φλόγας ιονισμού (GC-FID) και υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης συνδεδεμένη με φασματομετρία μαζών (HPLC/MS). Η χρωματογραφική ανάλυση αποτέλεσε παράλληλα «δείκτη ελέγχου» της ποιοτικής ιστοχημικής μελέτης. Στα αείφυλλα σκληρόφυλλα έγινε μια επιπλέον σύγκριση του είδους και της σχετικής αφθονίας των κύριων δευτερογενών μεταβολιτών σε δύο διαφορετικές εποχές, το θέρος και τον χειμώνα. Τέλος, όπως προαναφέρθηκε, στα πλαίσια της παρούσας Διατριβής, διενεργήθηκε έλεγχος παρουσίας βιοενεργών μορίων με αντιμικροβιακή δράση. Ο έλεγχος βιοδραστικότητας έγινε με δυο μεθόδους: τη μέθοδο διάχυσης βιοδραστικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (Disc Diffusion Method) και τη μέθοδο διάχυσης βιοδραστικής ουσίας από κοιλότητες (πηγαδάκια) (Agar Well Diffusion Method). Για τον έλεγχο αντιμικροβιακής δράσης χρησιμοποιήθηκαν Πρότυπα βακτηριακά (Escherichia coli ATCC25922, Staphylococcus aureus ATCC29213, Pseudomonas aeuroginosa ATCC27853) και κλινικά στελέχη (S. aureus, P. aeuroginosa, Streptococcus sp, Candida albicans). Η αναστολή ανάπτυξης προσδιορίστηκε μετρώντας τη διάμετρο της ζώνη αναστολής. Τα προϊόντα της υδροαπόσταξης φύλλων από το είδος Pistacia lentiscus L. var Chia ελέγχθηκαν για την παρουσία βιοενεργών μορίων με αντιμικροβιακή δράση και ενάντια σε πολυανθεκτικά κλινικά στελέχη [(Methicillin-resistant S. aureus (MRSA), Carbapenem - Resistant Metallo-βLactamase (carbapenemase) P. aeruginosa (VIM), Klebsiella pneumoniae carbapenemases (KPCs) και Acinetobacter baumanii)]. Η παρούσα διατριβή παρουσιάζει για πρώτη φορά μια ολοκληρωμένη μελέτη Ελληνικών φαρμακευτικών φυτικών ειδών. Αποτελεί μια συστηματική προσπάθεια να αποδοθούν οι αντιμικροβιακές ιδιότητες φαρμακευτικών φυτών σε συγκεκριμένες ανατομικές δομές και στην παρουσία ειδικών δευτερογενών μεταβολιτών. Φαρμακευτικές χρήσεις, κατά τον έλεγχο παρουσίας αντιμικροβιακών παραγόντων, παρουσίασαν τα P. lentiscus. Επίσης, για πρώτη φορά αναφέρεται η δημιουργία in-vitro μαζών φυτικών κυττάρων από τα φαρμακευτικά είδη F. carica L. και O. alba L..