Χαρτογράφηση μεταβολιτών σε μελέτες τοξικότητας με τη μέθοδο της ολιστικής ανάλυσης βιολογικών δειγμάτων

Abstract

Metabonomics involves the application of advanced analytical tools (NMR, MS) to profile the diverse of biological fluids or tissue. Multivariate statistical analysis of the complex spectral profiles enables discrimination between phenotypes of interest and identifies discriminatory metabolites that represent candidate biomarkers. This thesis aims to evaluate metabolic profiling UPLC-MS approach as a tool in pre-clinical toxicological studies. In order to address this aim UPLC-MS was used to investigate the metabolic effects of the hepatotoxin galactosamine (galN) and the mechanism by which glycine protects against such toxicity. Histopathological and clinical chemistry analyses confirmed the protective effect of glycine and revealed interindividual variability in the toxic response at the cohort of rats treated with galN enabling the classification of ‘responder’ and ‘non-responder’ phenotypes.In order to enhance the metabolome coverage a hydrophilic interaction chromatography (HILIC) UPLC-MS method for explaratory urinary metabolic profiling was developed and can be used complementary to the traditionally used reversed-phese (RP) UPLC-MS method. Moreover an efficient and reproducible protocol was developed and optimized for fecal untargeted metabolic profiling by UPLC-MS. In both methods the within-run repeatability and stability over large sample sets was assessed through the repeat analysis of a quality control sample. Then the metabolic profiles of urine, serum, feces and liver tissue were determined in the studies of the hepatotoxic action of galN using both RP and HILIC UPLC-MS methods in positive and negative electrospray (ESI) modes. The data revealed excellent classification of biofluids and tissues metabolic profiles according to treatment and inter-animal variability in response to galN with significant changes observed in specific endogenous metabolites after galN exposure. This metabonomic approach enabled simultaneous characterization of the xenobiotic and endogenous metabolic pertubations at the toxicity study of galN.

Τα τελευταία χρόνια η αλματώδης ανάπτυξη των φασματοσκοπικών τεχνικών και της υπολογιστικής ισχύος έχει κάνει εφικτή την ολιστική προσέγγιση των βιολογικών δειγμάτων μέσω της μεταβονομικής/ μεταβολομικής (metabonomics/ metabolomics). Η μεταβονομική είναι ένα νέο διεπιστημονικό πεδίο που εφαρμόζει υψηλής-αποδοτικότητας (high-throughput) τεχνολογίες στον προσδιορισμό μικρού μοριακού βάρους βιομορίων που εμπλέκονται σε διάφορα βιοχημικά μονοπάτια. Με την εφαρμογή της μεταβονομικής στην τοξικολογική ανάλυση πραγματοποιείται διερεύνηση του συνόλου των ενδογενών μεταβολιτών ενός βιολογικού δείγματος (μεταβολικό προφίλ) με απώτερο σκοπό τον εντοπισμό αλλαγών στον οργανισμό που προκαλούνται από την έκθεση του οργανισμού στην τοξική ουσία ή φάρμακο. Το αντικείμενο της διατριβής εντάσσεται στο σύγχρονο ερευνητικό πεδίο της μεταβονομικής στην τοξικολογία. Στόχος μας ήταν η ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης ολικού μεταβολικού προφίλ χρησιμοποιώντας την αναλυτική τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υπερ-υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με φασματομετρία μαζών (UPLC-MS) και η εφαρμογή αυτών των μεθόδων στη μελέτη της τοξικής δράσης της γαλακτοζαμίνης (galN) για την περαιτέρω κατανόηση του μηχανισμού ηπατοξικότητας που προκαλεί. Αρχικά αναπτύχθηκε μέθοδος HILIC-UPLC-MS για την ανάλυση μεταβολικού προφίλ ούρων, η οποία μπορεί να ενισχύσει την ολιστική προσέγγιση του προφίλ μεταβολιτών στα υπό εξέταση δείγματα και μπορεί να εφαρμοστεί ως συμπληρωματική τεχνική της RP-UPLC-MS αυξάνοντας τον αριθμό των μεταβολιτών που μπορούν να προσδιοριστούν σε ένα βιολογικό δείγμα. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μέθοδος προκατεργασίας δειγμάτων κοπράνων για την ανάλυση μεταβολικού προφίλ η οποία αξιολογήθηκε όσον αφορά την επαναληψιμότητά της και την αξιοπιστία της. Τέλος, οι μέθοδοι αυτές χρησιμοποιήθηκαν στις πειραματικές μελέτες του μηχανισμού ηπατοξικότητας της γαλακτοζαμίνης. Η αξιολόγηση των δεδομένων φανέρωσε υψηλή σταθερότητα του συστήματος UPLC-MS που χρησιμοποιήθηκε, καθ’ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων, δίνοντας έτσι δεδομένα άριστης ποιότητας για την περαιτέρω στατιστική ανάλυση.Στην πρώτη πειραματική μελέτη χορηγήθηκε galN σε επίμυες και μελετήσαμε τις αλλαγές στα μεταβολικά προφίλ των βιολογικών δειγμάτων ούρων, ορού αίματος, ήπατος και κοπράνων. Στη δεύτερη μελέτη χορηγήθηκε ταυτόχρονα galN και γλυκίνη σε επίμυες και μελετήθηκε η προστατευτική δράση της γλυκίνης όταν χορηγείται σε συνδυασμό με τη galN. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση των βιολογικών δειγμάτων και στις δύο πειραματικές μελέτες κατέδειξαν ότι τα μεταβολικά προφίλ αυτών διαφέρουν σημαντικά λόγω της ανάπτυξης ηπατοτοξικότητας στους επίμυες. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα αποτελέσματα των ιστοπαθολογικών εξετάσεων και των αναλύσεων κλινικής χημείας. Η ανταπόκριση κάθε πειραματόζωου στην galN ποικίλει κατατάσσοντας τους επίμυες σε responders και non-responders. Τα μεταβολικά προφίλ των δειγμάτων της ομάδας ελέγχου βρέθηκαν να διαφέρουν από αυτά των πειραματόζωων που χαρακτηρίζονται ως non-responders. Συγκρίνοντας την ομάδα επίμυων στους οποίους χορηγήθηκε ταυτόχρονα galN+gly με την ομάδα ελέγχου δεν βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στα μεταβολικά προφίλ των βιολογικών τους δειγμάτων. Η ολιστική ανάλυση μεταβολικού προφίλ κατέδειξε διαφορές σε ενδογενείς μεταβολίτες που εμπλέκονται σε διάφορα σημαντικά μεταβολικά μονοπάτια. Η τάση αύξησης ή μείωσης των μεταβολιτών αυτών αναστέλλεται όταν χορηγείται ταυτόχρονα gly με την galN. Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι: Η απέκκριση της glcNAc, της galN και των πυραζινών της σχετίζονται με το βαθμό της ηπατικής βλάβης των επίμυων που ανταποκρίθηκαν στην τοξικότητα και αποτελούν δείκτες εμφάνισης ηπατοτοξικότητας της galN. Επίσης, η ανάλυση ολικού μεταβολικού προφίλ ούρων, ήπατος και ορού αίματος κατέδειξε διαταραχή στη βιοσύνθεση και στο μεταβολισμό των αμινοξέων στο ήπαρ, στη βιοσύνθεση των πυριμιδινών και των πουρινών, στο μεταβολικό μονοπάτι της μεθειονίνης και της ιστιδίνης, στη μεταβολική δραστηριότητα της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας, στα επίπεδα των ενδιάμεσων προϊόντων του κύκλου του Krebs και στην παραγωγή των χολικών οξέων. Τέλος, τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την ολιστική ανάλυση των δειγμάτων ούρων ανέδειξαν αυξημένα επίπεδα οροτικού οξέος και ουριδίνης στην ομάδα χορήγησης γλυκίνης σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Τα αυξημένα επίπεδα οροτικού οξέος συνηγορούν στην αυξημένη παραγωγή UMP και κατ’ επέκταση αύξηση των μορίων που αποτελούν δότες ουριδίνης γεγονός που συμβάλει στο μηχανισμό προστασίας από την εμφάνιση τοξικότητας. Τα αποτελέσματα των πειραματικών μελετών επιβεβαιώνουν και ενισχύουν τα ευρήματα των προηγούμενων μελετών ανάλυσης ολικού μεταβολικού προφίλ στη μελέτη της ηπατοτοξίνης galN με την τεχνική NMR. Με την παρούσα διατριβή βελτιώνεται η γνώση μας όσον αφορά τις αλλαγές που υφίστανται στα μεταβολικά προφίλ των βιολογικών δειγμάτων επίμυων που έχουν αναπτύξει ηπατοτοξικότητα εξαιτίας της χαρήγησης galN σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν τη σημαντικότητα της εφαρμογής πολλαπλών αναλυτικών τεχνικών (π.χ. NMR και MS) για τη συλλογή όσο το δυνατόν περισσότερης πληροφορίας στην ανάλυση μεταβολικού προφίλ.