Γενετική διερεύνηση ανευρύσματος κοιλιακής αορτής

Abstract

Purpose: The purpose of the present thesis is the investigation of the role of genes involved in cholesterol efflux mechanism in Abdominal Aortic Aneurysm (AAA) and its contribution to aneurysm’s pathology, as well as their epigenetic regulation through microRNAs. Methods: Experiments were performed in AAA, atherosclerotic (ATH) and normal abdominal aortic tissues. Expression of genes involved in cholesterol efflux mechanism was evaluated using Real-time PCR, Western blot and immunohistochemistry. Staining of aortic tissue sections with (a) toluidine O Blue and Oil Red O, (b) antibodies against α-SM and CD68 and co-staining with Oil Red O and (c) double staining with vimentin and α-SM, was used for the investigation of lipid accumulation, foam cells presence and smooth muscle cells (SMCs) phenotype, respectively. Finally, the role of miR-10b in the regulation of cholesterol efflux related genes and SMCs phenotype was investigated after its inhibition with anti-miR-10b treatment in AAA-SMCs. Results: Histochemical analysis showed excessive lipid accumulation in AAA, while co-staining using Oil Red O with α-SM or CD68 showed lipid accumulation in SMCs and macrophages, respectively. Moreover, double staining for α-SM and vimentin revealed vimentin expression in the intima and inner media layer of AAA with vimentin positive SMCs designating SMCs phenotype switch from contractile to synthetic. Additionally, we observed that LXRα, LXRβ and ABCA1 mRNA expression levels were decreased in AAA compared to ATH-whole tissues, as well as in AAA intima-media compared to ATH and normal intima-media layers. Furthermore, immunohistochemical analysis demonstrated that LXRα and ABCA1 immunoreactivities (IR) were decreased in the AAA media compared to the normal and ATH media layers and that they were also reduced in the intima layer of AAA and ATH tissues, whereas ApoAI-IR was increased in the AAA and ATH aortic wall compared to normal depicting deregulation of cholesterol efflux mechanism in AAA. Finally, miR-10b was found to be elevated in AAA intima-media layers compared to normal, while anti-miR-10b treatment in AAA-SMCs resulted in an increase of ABCA1 expression, key molecule in cholesterol efflux mechanism, as well as in increase of α-SM and decrease of vimentin protein expression levels, markers for the contractile and synthetic SMCs, respectively. Conclusion: The present thesis provides novel evidence for impaired expression of genes involved in cholesterol efflux in AAA associated with lipid accumulation in SMCs and macrophages, as well as switch of SMCs phenotype from contractile to synthetic form. Moreover, provides evidence for a possible role of miR-10b in the regulation of ABCA1 and proteins related with SMCs phenotype and could be proposed as a therapeutic target for AAA treatment, highlighting the clinical importance of our results.

Σκοπός: Αντικείμενο της διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση του ρόλου των γονιδίων που ενέχονται στο μηχανισμό εκροής της χοληστερόλης (RCT) στο ανεύρυσμα κοιλιακής αορτής (ΑΚΑ), η συμβολή τους στην παθογένεια της νόσου και τέλος πιθανοί μηχανισμοί επιγενετικής ρύθμισης αυτών. Μεθοδολογία: Τα πειράματα διεξήχθησαν σε ιστούς ΑΚΑ, αθηρωματικής και φυσιολογική κοιλιακής αορτής. Ο προσδιορισμός της έκφρασης γονιδίων που ενέχονται στο μηχανισμό RCT πραγματοποιήθηκε με τις μεθόδους της Real-Time PCR, του Western blot και της ανοσοϊστοχημείας. Επιπλέον, σε τομές αορτικού ιστού πραγματοποιήθηκε (α) χρώση με το μπλε της τολουϊδίνης και Oil Red Ο, (β) σήμανση με αντισώματα έναντι των α-SM και CD68 και επακόλουθη χρώση με Oil Red O και (γ) διπλή σήμανση με α-SM και βιμεντίνη, για τη διερεύνηση της συσσώρευσης λιπιδίων, παρουσίας αφρωδών κυττάρων και του φαινοτύπου των λείων μυϊκών κυττάρων (ΛΜΚ), αντιστοίχως. Τέλος, έγινε χορήγηση με τον αναστολέα του miR-10b σε ΑΚΑ-ΛΜΚ για να διερευνηθεί ο ρόλος του στη ρύθμιση των γονιδίων που σχετίζονται με το μηχανισμό RCT και το φαινότυπο των ΛΜΚ. Αποτελέσματα: Ιστολογική ανάλυση έδειξε συσσώρευση λιπιδίων και παρουσία αφρωδών κυττάρων προερχόμενων από ΛΜΚ και μακροφάγα στο τοίχωμα ανευρυσματικής αορτής. Επιπροσθέτως, ανοσοϊστοχημική μελέτη έδειξε έκφραση της α-SM και βιμεντίνης σε ΑΚΑ-ΛΜΚ και απουσία βιμεντίνης στη φυσιολογική αορτή, συνηγορώντας στη φαινοτυπική διαφοροποίηση των ΑΚΑ-ΛΜΚ από το συσταλτικό στο συνθετικό φαινότυπο. Επιπλέον, παρατηρήσαμε μειωμένα μεταγραφικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων LXRα, LXRβ και ΑBCΑ1 στο συνολικό τοίχωμα ΑΚΑ αορτής συγκριτικά με της αθηρωματικής, καθώς επίσης μειωμένη βρέθηκε και η έκφρασή τους στον υποενδοθηλιακό χώρο ΑΚΑ αορτής συγκριτικά με της αθηρωματικής και φυσιολογικής. Επιπροσθέτως, ανοσοανίχνευση των LXRα και ABCA1 έδειξε μειωμένα πρωτεϊνικά επίπεδα αυτών στο μεσαίο χιτώνα του ΑΚΑ συγκριτικά με της αθηρωματικής και φυσιολογικής αορτής, καθώς επίσης μειωμένα ήταν τα πρωτεϊνικά τους επίπεδα στον έσω συγκριτικά με το μεσαίο χιτώνα στο ΑΚΑ, όπως και στην αθηρωμάτωση. Αντιθέτως, αύξηση παρατηρήθηκε στην πρωτεϊνική έκφραση της ApoAI στους χιτώνες της ΑΚΑ αορτής υποδεικνύοντας, σε συνδυασμό με τα παραπάνω, απορρύθμιση του μηχανισμού RCT στο ανεύρυσμα. Τέλος, η αναστολή του υπερεκφραζόμενου στο ΑΚΑ miR-10b επέφερε αύξηση στα επίπεδα έκφρασης της ABCA1, μορίου-κλειδί στην εκροή της χοληστερόλης και της α-SM, πρωτεϊνικού δείκτη του φυσιολογικού συσταλτικού φαινοτύπου των ΛΜΚ, ενώ μείωση παρατηρήθηκε στην έκφραση της βιμεντίνης, δείκτη του παθολογικού φαινοτύπου των ΛΜΚ. Συμπεράσματα: Αναδείχθηκε ότι διαταραχές στην έκφραση των γονιδίων, LXR, ABCA1 και ApoAI, που ενέχονται στο μηχανισμό εκροής της χοληστερόλης στο ΑΚΑ, επάγουν τη συσσώρευση λιπιδίων και τη μετατροπή ορισμένων μακροφάγων και ΛΜΚ σε αφρώδη κύτταρα, ενώ επίσης σχετίζονται με τη φαινοτυπική διαφοροποίηση των ΛΜΚ προς τον παθολογικό συνθετικό φαινότυπο. Επιπροσθέτως, αναδείχθηκε πιθανός ρόλος του miR-10b στη ρύθμιση του γονιδίου ABCA1, καθώς και των γονιδίων που σχετίζονται με το φαινότυπο των ΛΜΚ αναδεικνύοντας το miR-10b ως πιθανό μοριακό στόχο για την αναστολή της εξέλιξης του ανευρύσματος.