Εγγενής ανοσία και κλινική έκβαση της λοίμωξης από τον ιό της ηπατίτιδας Β στα παιδιά

Abstract

Hepatitis B virus infection in childhood remains a consirable health problem worldwide,even after the introduction of passive and active immunoprophylaxis for children born toHBV positive mothers. The great majority (90%) of newborns that will acquire HBVduring their perinatal period and a significant percentage (30%) of children that will acquireHBV infection during their first 6 years of life will develop chronic infection, compared toa lesser degree (10%) of adults. The risk of HBV transmission from an HBsAg positivemother to her infant is associated with different factors including the timing of exposure,the maternal HBeAg carriage associated with significant infectivity and the viral load atbirth.The contribution of genetic factors to the outcome of ΗΒV infection is shown in recentgenetic association studies. Mannose binding lectin (MBL) is an innate immunity factorknown to activate the complement after binding to HBV surface glycoproteins and to elicit viral opsonisation. Variants in mbl2 gene, including the single point mutations in exon 1(codons 54 and 57) and at position 221 of the promoter reduce plasma MBL levels. MBLdeficiency has been related to increased susceptibility to infections in infants and pooroutcome of hepatitis B and C in adults.Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) is also an efficient factor of HBV clearance, able todisrupt viral particles, transcriptional templates and episomal covalently closed circularDNA. Plasma TNF-α level is modified by a variant at position −308 of its gene. Vitamin Daffects viral presentation by suppressing antigen presentation and effector T cells activationin a vitamin D receptor (VDR) transcription-dependent way. Low level of viral antigens,expressed by antigen presenting cells, are unable to induce the CD4 T cells but sufficient to activate cytotoxic T cells, which mediate liver injury without clearing HBV. Two variantsin the VDR gene, ApaI A/a at intron 8 and TaqI T/t at exon 9, have already been related tothe outcome of hepatitis B in adults.The effect of the mbl2 (Cdn54 GGC to GAC, Cdn57 GGA to GAA, -221 G to C), TNF-α (-308 A to G) and VDR gene (ApaI G toT, TaqI T to C) variants on the acquisition of HBVinfection and the outcome of infection (progress to chronicity or clearance) was studied on102 children and adolescents (53 male and 49 female), aged 0.5 to 18.5 years (mean age9.17 years), who were born to HBV positive mothers and had not receivedimmunoprophylaxis. The children were assessed for HBV serology and those found to beHBsAg positive were retested later for potential HBsAg seroconversion. The group ofchronic HBV infection (presence of HbsAg for more than 6 months) consisted of 33HBsAg positive children, 14 male and 19 female, aged 3.0 to 18.5 (mean 11.4) years. Thegroup of spontaneous HBV clearance (disappearance of HbsAg and the development of anti-Hbs antibodies) consisted of 36 children, 17 male and 19 female, aged 0.5 to 18 (mean9.47) years and the group of naïve subjects consisted of 33 children, 22 male and 11female, aged 1.0 to 14 (mean 6.58) years. Initially genomic DNA was isolated from wholeblood, followed by polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment lengthpolymorphism (RFLP) methods and electrophoresis in agarose gels. MBL serum levelswere determined in 28, 32, and 16 children with HBV chronic infection, clearance andnaivety, respectively by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). MBLlevels were defined as low when <500 and normal when >500 ng/ml. The allele, genotype, haplotype frequencies and MBL levels were compared among thegroups with Fisher’s exact probability test and risk ratios (RR) and 95% confidenceintervals (CI) were calculated. The following differences were observed:Females were at higher risk of acquiring HBV infection than males (p=0.032), but not at adifferent risk of progressing to chronicity (p=0.44).The prevalence of mutant alleles in codons 54 and 57 and at position -221 and thedistribution of mbl2 haplotypes did not differ among the study groups. Low serum MBLvalues were found in 13.2% of the whole cohort, in 10.7% of children with chronicinfection, 15.6% of children with HBV clearance and 12.5% of HBV naïve subjects. MBLdeficiency as defined by mbl2 genotypes or MBL serum levels was not shown to havesignificant impact in early HBV infection.TNF-alpha-308 G allele was found more frequently in children with chronic infection thanin HBV naïve children (p=0.050) and in infected than non-infected children, though not at asignificant level (p 0.089).VDR ApaI A allele (as compared to a allele) was more frequent, though at a marginal levelof significance, in children with chronic than in children with resolved infection (p=0.071).On the other hand, VDR ApaI α allele in VDR ApaI and TaqI joint haplotype αΤ (ascompared to At and AT haplotypes) was more frequent in children with resolved than inchildren with chronic infection (p=0.049). TaqI and ApaI markers were found to be inlinkage disequilibrium, consistently with the findings of previous studies. Three jointgenotypes (AAtt, AaTt, aaTT) were more common exhibiting frequencies of 22.5%, 39.2%and 17.6% compared to the less common genotypes AATt, AATT, AaTT (9.8%, 2.9% and7.8%, respectively). Our findings suggest that TNF-alpha and possibly vitamin D pathways may be involved inthe progress of early HBV infection. The present study as all genetic association studiesprovide a better understanding of HBV infection pathogenesis early in life. Future globalmulticohort studies that will include multiple genetic variations, haplotypes and clinicaldata are required for the clarification of HBV immunogenetics. Polymorphisms may serveas genetic markers and facilitate the estimation of long-term outcome. Genetic studies raisehopes of the emergence of automated, rapid and affordable tools in the diagnostics andmanagement of hepatitis B.

Η λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας Β στης παιδική ηλικία παραμένει παγκόσμιοπρόβλημα, παρά τη χορήγηση παθητικής και ενεργητικής ανοσοποίησης στα παιδιά πουγεννιούνται από HBV θετικές μητέρες. Το μεγαλύτερο ποσοστό των νεογνών (90%) πουθα αποκτήσουν τη λοίμωξη περιγεννητικά και ένα σημαντικό ποσοστό των παιδιών (30%)που θα μολυνθούν από τον ιό στα πρώτα 6 χρόνια της ζωής τους θα αναπτύξουν χρόνιαλοίμωξη, συγκριτικά με το μικρότερο ποσοστό (10%) των ενηλίκων. Ο κίνδυνοςμετάδοσης του HBV από μία HBsAg θετική μητέρα στο βρέφος εξαρτάται από διάφορουςπαράγοντες, συμπεριλαμβανομένων της χρονικής περιόδου της έκθεσης του νεογνού, τηςμητρικής φορείας του HBeAg αντιγόνου που συνδέεται με υψηλή μολυσματικότητα καιτου μητρικού ιικού φορτιού στη γέννηση.Η συμβολή των γενετικών παραγόντων στην έκβαση της λοίμωξης αναδεικνύεται σεπρόσφατες μελέτες συσχέτισης της νόσου με υποψήφιους γονιδιακούς τόπους. Η συνδεόμενη στη μαννόζη λεκτίνη (mannose binding lectin-MBL) είναι ένας παράγονταςτης εγγενούς ανοσίας, που αποτελεί γνωστό ενεργοποιητή του συμπληρώματος, μετά τηνσύνδεση με επιφανειακές γλυκοπρωτεΐνες του ιού και μπορεί να ενεργοποιήσει την ιικήωψονινοποίηση. Οι ποικιλίες του γονιδίου της MBL (mbl2), συμπεριλαμβανομένων τωνμονοσημειακών μεταλλαγών στο εξόνιο 1 (κωδικόνιο 54 και 57) και στη θέση -221 τουυποκινητή, προκαλούν μείωση της έκφρασης και των επιπέδων της λεκτίνης. Η ανεπάρκειατης MBL έχει συσχετιστεί με αυξημένη ευπάθεια στις λοιμώξεις στη βρεφική ηλικία καιφτωχή πρόγνωση της ηπατίτιδας Β και C στην ενήλικο ζωή. Ο παράγοντας νέκρωσης τουόγκου (tumour necrosis factor alpha-TNF-α) είναι επίσης ένας δραστικός παράγοντας ιικήςκάθαρσης, καθώς μπορεί να διασπά τα υιικά σωματίδια, τα μεταγραφικά πλαίσια και το επισωματικό κλειστό με ομοιοπολικού δεσμούς κυκλικό DNA (ccc). Τα επίπεδα TNF-αορού τροποποιούνται από μία ποικιλία στη θέση -308 του γονιδίου του. Τέλος, η βιταμίνηD επηρεάζει την ιική παρουσίαση μέσω της καταστολής της αντιγονικής έκφρασης και τηςαναστολής της ενεργοποίησης των Τ δραστικών κυττάρων με τη μεταγραφική μεσολάβησητου υποδοχέα της VDR. Έτσι χαμηλά επίπεδα ιικών αντιγόνων, τα οποία εκφράζονται απότα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, είναι ανεπαρκή να ενεργοποιήσουν τα CD4 Τκύτταρα, επαρκή όμως να ενεργοποιήσουν τα κυτταροτοξικά T κύτταρα, τα οποίαπροκαλούν ηπατική βλάβη χωρίς να επιφέρουν ιιική κάθαρση. Δύο γενετικοί τόποι τουγονιδίου του VDR, ApaIA/α στο ιντρόνιο 8 και TaqIT/t στο εξόνιο 9, έχουν ήδησυσχετιστεί με την έκβαση της ηπατίτιδας Β στους ενήλικες.Μελετήθηκε η επίδραση των πολυμορφισμών των γονιδίων mbl2 (Cdn54 GGC σε GAC,Cdn57 GGA σε GAA, -221 G σε C), TNF-α (-308 A σε G) και VDR (ApaI G σε T, TaqI T σε C) στη μετάδοση της HBV λοίμωξης και στην έκβαση της, δηλαδή την ιική κάθαρση ήτην εξέλιξη σε χρόνια νόσο σε 102 παιδιά και έφηβους (53 αγόρια και 49 κορίτσια)ηλικίας 0.5 με 18.5 (μέση ηλικία 9.17) έτη, τα οποία είχαν γεννηθεί από HBV θετικέςμητέρες και δεν είχαν λάβει ανοσοπροφύλαξη. Τα παιδιά ελέγχθηκαν ορολογικά για τονHBV και όσα βρέθηκαν θετικά για τον HBsAg ελέγχθηκαν αργότερα για ενδεχόμενηHBsAg ορομετατροπή.Η ομάδα των χρόνιων παιδιών (παρουσία του HBsAg για διάστημα μεγαλύτερο των 6μηνών στον ορό) αποτελούνταν από 33 HBsAg θετικά παιδιά, 14 άρρενα και 19 θήλεα,ηλικίας 3.0 με 18.5 ετών (μέση ηλικία 11.4) έτη. Η ομάδα των παιδιών με παλιά λοίμωξη(εξαφάνιση του HBsAg και την ανάπτυξη anti-Hbs αντισωμάτων) περιελάμβανε 36 παιδιά,17 άρρενα και 19 θήλεα, ηλικίας 0.5 με 18 (μέση ηλικία 9.47) έτη και η ομάδα των παιδιών χωρίς στοιχεία λοίμωξης αποτελούνταν από 33 παιδιά, 22 άρρενα και 11 θήλεα, ηλικίας 1.0με 14 (μέση 6.58) έτη. Αρχικά έγινε απομόνωση γενωμικού DNA από ολικό αίμα,ακολούθησαν PCR, RFLP και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Τέλος μετρήθηκαντα επίπεδα MBL του ορού με τη μέθοδο του ανοσοενζυμικού προσδιορισμού (ELISA) σεδείγματα ορού από 28 παιδιά με χρόνια λοίμωξη, 32 παιδιά με παλιά λοίμωξη και 16παιδιά ελέγχου. Τα επίπεδα MBL ορίστηκαν χαμηλά όταν ήταν <500 ng/ml καιφυσιολογικά όταν ήταν ≥500 ng/ml.Έγινε σύγκριση των συχνοτήτων αλληλομόρφων, των γονοτύπων, των απλοτύπων και τωνεπιπέδων MBL μεταξύ των ομάδων με Fisher’s exact probability test και υπολογίστηκαν ταrisk ratios (RR) και τα κατά 95% confidence intervals (CI 95%). Αναδείχτηκαν οιπαρακάτω διαφορές:Τα θήλεα άτομα είχαν μεγαλύτερο κίνδυνο να αποκτήσουν τη λοίμωξη συγκριτικά με τα άρρενα άτομα (p=0.032) αλλά δεν είχαν διαφορετική πιθανότητα να αναπτύξουν χρόνιαHBV λοίμωξη (p=0.44).Δε φάνηκε να διαφέρουν σημαντικά οι συχνότητες των μεταλλαγμένων αλληλομόρφωνστα κωδικόνια 54 και 57 και στη θέση -221 του mbl2 καθώς και η κατανομή των mbl2απλοτύπων ανάμεσα στις ομάδες. Χαμηλά επίπεδα MBL βρέθηκαν στο 13.2% του ολικούπληθυσμού, σε 10.7% των παιδιών με χρόνια λοίμωξη, 15.6% των παιδιών με παλιάλοίμωξη και 12.5% των παιδιών χωρίς καμία ένδειξη λοίμωξης. Η ανεπάρκεια της MBLπου ορίζεται από τους γονότυπους του γονιδίου mbl2 ή από τα επίπεδα ορού της λεκτίνης,φαίνεται να έχει μικρή επίδραση στην πρώιμη HBV λοίμωξη.Το -308G αλληλόμορφο στο γονίδιο του TNF-α βρέθηκε συχνότερα σε παιδιά με χρόνιαλοίμωξη σε σύγκριση με τα παιδιά ελέγχου (p=0.050) και στα παιδιά που μολύνθηκαν σε σύγκριση με εκείνα που δε μολύνθηκαν από τον ιό, παρόλο που δεν έφτασε επίπεδαστατιστικής σημαντικότητας (p 0.089).Το αλληλόμορφο VDR ApaI A βρέθηκε πιο συχνά σε παιδιά με χρόνια λοίμωξη σεσύγκριση με τα παιδιά με παλιά λοίμωξη, παρόλο που το εύρημα δεν έφτασε επίπεδοστατιστικής σημαντικότητας (p=0.071). Αντίθετα το αλληλόμορφο VDR ApaI α μέρος τουVDR ApaI and TaqI απλότυπου αΤ (σε σύγκριση με τους απλότυπους At και AT) ήταν πιοσυχνό εύρημα σε παιδιά με παλιά λοίμωξη από εκείνα με χρονιότητα (p=0.049). Οιγενετικοί δείκτες TaqI και ApaI βρέθηκαν σε «ανισορροπία σύνδεσης» και τρεις μικτοίγονότυποι (AAtt, AaTt, aaTT) ήταν πιο συχνοί με συχνότητες 22.5%, 39.2% and 17.6%αντίστοιχα σε σύγκριση με τους λιγότερο συχνούς γονότυπους AATt, AATT, AaTT (9.8%,2.9% και 7.8%, αντίστοιχα).Τα ευρήματα μας υποδεικνύουν ότι το μονοπάτι του TNF-α και πιθανά της vitamin Dμπορεί να εμπλέκονται στην εξέλιξη της πρώιμης HBV λοίμωξης. Η συγκεκριμένη μελέτη,όπως όλες οι σχετικές μελέτες συσχέτισης επεκτείνουν την κατανόηση της παθογένειας τουHBV στα αρχικά στάδια της ζωής. Η διευκρίνιση της ανοσογενετικής του HBV χρήζειπαγκόσμιες πολυπληθυσμιακές μελλοντικές μελέτες, που θα περιλαμβάνουν πολλαπλέςποικιλίες και απλότυπους και θα ενσωματώνουν γενετικά και κλινικά δεδομένα. Οιπολυμορφισμοί μπορεί να χρησιμοποιηθούν στο μέλλον ως γενετικοί δείκτες στηνεκτίμηση της μακροπρόθεσμης πρόγνωσης και την αναγνώριση των ατόμων που ενέχουνμεγαλύτερο κίνδυνο να αναπτύξουν λοίμωξη και να έχουν φτωχή έκβαση. Οι γενετικέςμελέτες συσχέτισης τέλος αφήνουν ελπίδες για την ανάπτυξη αυτοματοποιημένων,γρήγορων και προσιτών εργαλείων στη διαγνωστική και στη θεραπευτική της ηπατίτιδαςΒ.