Βιοχημικές και ανοσοβιολογικές μεταβολές των πρωτεογλυκανών σε κακοήθη νεοπλάσματα του γαστρεντερικού συστήματος

Abstract

Cancers of gastrointestinal tract are the most common type of cancers in developed world. Colorectal cancer has the highest incidence, however it is treated with rather good prognosis. On the other hand, pancreatic cancer has very bad prognosis and in most cases it cannot be treated. The last years extended research focused to the extracellular macromolecules of cancer, their role in cancer progression and their possible use as drug targets. The present Thesis aimed to study the extracellular proteoglycans structure in pancreatic cancer and the hyaluronan metabolism in colorectal cancer. The first was investigated by using a combination of biochemical and immunohistochemical techniques, and from their results it was found that two extracellular proteoglycans were present in pancreatic carcinoma, versican and decorin. Both proteoglycans were detected in the stroma and were absent from cancer cells, suggesting their biosynthesis from normal fibroblasts. In addition, their amounts were highly increased in pancreatic carcinoma, as compared with normal pancreas. Their increase in cancer was disproportional. Versican was increased 27 times and decorin 7 times, as compared with normal pancreas. Versican increase is related to its structural, hydration and space-filling properties, as well as to its function, since it is a multifunctional macromolecule. Versican enhances cell proliferation, and together with its anti-adhesive properties, allows mainly uncontrolled cellular growth locally. The lower increase of decorin, as compared with that of versican, could explain aggressiveness and malignancy of pancreatic cancer. Proteoglycans increase was followed by extensive alterations in their biochemical structure, namely, hydrodynamic size, sulphation pattern, and epimerization of glucuronate to iduronate. These should be attributed to multiple alterations of their biosynthetic pathways. The second was investigated by using a combination of enzymatic, immunoenzymatic and molecular techniques, and from their results it was found that multiple forms of Hyal1 and PH20 were present in all samples, as well as all hyaluronan synthases (HASs). Hyal2 and Hyal3 were present in some samples of advanced stage of cancer. Changes in expression with cancer stage were observed. Hyal1 expressed in low levels in apparently macroscopically normal parts of stage A samples, and its expression was 10 times greater in the respective cancerous. This finding suggested that Hyal1 is produced from cancer cells. Hyal1 expression showed a stage-related decrease and since its activity results to hyaluronan fragments of angiogenetic size, it could be concluded that Hyal1 is required at early stage of cancer. PH20 expressed in a higher rate than Hyal1 in apparently macroscopically normal parts of stage A samples, and its expression was 4 times greater in the respective cancerous, suggesting its participation in angiogenesis. In advanced stages, PH20 expression was slightly increased, suggesting its participation in extracellular matrix disorganization to permit cancer growth and progression, as well as metastasis. This was also observed in apparently macroscopically normal parts of samples of advanced stages. From the examination of the expression of the various HASs, a great and stage-related increase of HAS1 was found. This enzyme is responsible for the biosynthesis of hyaluronan of very high molecular size and thus it could be suggested that cancer regulates hyaluronan biosynthesis in such a way to fulfill cancer requirements in matrix hydration. HAS2 expression was also increased in a stage-related order only in cancerous samples, but the increase was lower than that of HAS1. This enzyme is responsible for the biosynthesis of hyaluronan of high molecular size which might be required for well-organized cancer growth. HAS3 expression was slightly decreased in a stage-related order, suggesting that its presence is stably required for the correct cancer growth and progression, since its biosynthetic product is of lower hydrodynamic size, as compared with that of HAS1 and 12 HAS2. Moreover, HAS3 expression was higher than that of both other HASs in samples of stage A, a stage very critical for angiogenesis. From the results obtained, it could be concluded that cancer cells combine a variety of multiple mechanisms for cancer growth, progression and invasion, and that extracellular macromolecules might play a very critical role. The mechanisms, as studied in the present Thesis, are: selective and highly regulated increase of the proteoglycans versican and decorin, selective modifications of glycosaminoglycans biochemical structure, selective and highly regulated expression of biosynthetic and catabolic enzymes related to hyaluronan. All these changes coordinate to fulfill cancer requirements for either angiogenesis or extracellular matrix organization, depending on its stage. Future studies will be oriented to chondroitin/dermatan sulphate structure/function relationship for better understanding of the role of these macromolecules in cancer, and of the regulatory mechanisms implicated in the expression of the enzymes involved in hyaluronan metabolism, aiming at the cancer treatment.

Οι καρκίνοι του γαστρεντερικού συστήματος είναι από τους πιο συνηθισμένους τύπους καρκίνου στον αναπτυγμένο κόσμο. Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι εκείνος με τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης, αλλά αντιμετωπίζεται με αρκετά καλή πρόγνωση. Αντίθετα, ο καρκίνος του παγκρέατος είναι εκείνος με τη χειρότερη πρόγνωση και πολλές φορές δεν αντιμετωπίζεται. Τα τελευταία χρόνια αναπτύσσεται εκτεταμένη έρευνα στα εξωκυττάρια μακρομόρια των καρκινικών ιστών και στο ρόλο τους στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, όπως επίσης και στις δυνατότητες επηρεασμού των παραγόντων αυτών φαρμακευτικά. Η παρούσα Διατριβή έχει δύο στόχους, ο πρώτος σχετίζεται με τη μελέτη των εξωκυττάριων πρωτεογλυκανών στον καρκίνο του παγκρέατος και ο δεύτερος με τη μελέτη του μεταβολισμού του υαλουρονικού οξέος στον καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω της μελέτης των βιοσυνθετικών και καταβολικών του ενζύμων. Ο πρώτος στόχος διερευνήθηκε με συνδυασμό βιοχημικών και ανοσοϊστοχημικών τεχνικών, από τα αποτελέσματα των οποίων διαπιστώθηκε ότι μόνο δύο πρωτεογλυκανικά μόρια ανευρίσκονται στο παγκρεατικό καρκίνωμα, η versican και η decorin. Και οι δύο πρωτεογλυκάνες εντοπίστηκαν στο στρώμα και απουσίαζαν πλήρως από τα καρκινικά κύτταρα, γεγονός που υποστηρίζει ότι παράγονται από τις ινοβλάστες του στρώματος. Ήταν σημαντική η αύξηση των ποσοτήτων των δύο πρωτεογλυκανών στο παγκρεατικό καρκίνωμα, σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας και μεγάλη η διαφορά που εμφάνιζαν μεταξύ τους. Η versican αυξήθηκε 27 φορές και η decorin 7 φορές, σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας. Η μεγαλύτερη αύξηση της versican σχετίζεται με τις ιδιότητες της πρωτεογλυκάνης, τόσο δομικές, ενυδατικές, χωροπληρωτικές, όσο και λειτουργικές, εφ’ όσον πρόκειται για πολυλειτουργικό μόριο. Επί πλέον, η versican συμβάλλει στην κατακόρυφη αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ενώ παράλληλα συμβάλλει και στις αντι-προσκολλητικές ιδιότητες των κυττάρων, παρέχοντας τη δυνατότητα για υπέρμετρη, και πολλές φορές ανεξέλεγκτη, κυτταρική ανάπτυξη σε τοπικό επίπεδο. Το γεγονός της χαμηλότερης αύξησης της συγκέντρωσης της decorin, σε σχέση με εκείνη της versican, θα μπορούσε να αποτελεί ένα μέτρο της επιθετικότητας του καρκίνου ή ακόμα, ένα μέτρο της κακοήθειας. Η αύξηση των πρωτεογλυκανών συνοδευόταν από σημαντικότατες αλλαγές στη βιοχημική δομή τους σε επίπεδο υδροδυναμικού μεγέθους, βαθμού και προτύπου θείωσης, όπως επίσης και επιμερίωσης του γλυκουρονικού σε ιδουρονικό. Οι αλλαγές αυτές θα μπορούσε να οφείλονται σε πολλαπλές αλλοιώσεις των βιοσυνθετικών μονοπατιών τους. Ο δεύτερος στόχος διερευνήθηκε με συνδυασμό ενζυμολογικών, ανοσοενζυμικών και μοριακών τεχνικών, από τα αποτελέσματα των οποίων διαπιστώθηκε σε όλα τα δείγματα η παρουσία των ισομορφών υαλουρονιδάσης Hyal1 και ΡΗ20, και σε πολλαπλές μορφές, αλλά και των Hyal2 και Hyal3, όμως μόνο σε προχωρημένο στάδιο, ως επίσης και η παρουσία των τριών συνθασών του υαλουρονικού. Παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή της έκφρασης με το καρκινικό στάδιο. Η Hyal1 εκφραζόταν σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα παχέος εντέρου με καρκίνο σταδίου Α, όμως η έκφρασή της ήταν πάνω από δέκα φορές μεγαλύτερη στα αντίστοιχα καρκινικά, υποστηρίζοντας ότι η Hyal1 παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα. Το γεγονός ότι η έκφραση της Hyal1 στα καρκινικά δείγματα εμφάνιζε σταδιο-εξαρτώμενη μείωση, σε συνδυασμό με το δεδομένο ότι η δράση της οδηγεί στην παραγωγή αγγειογενετικών θραυσμάτων υαλουρονικού, έρχεται σε συμφωνία με το δεδομένο ότι η διαδικασία της αγγειογένεσης απαιτείται κυρίως στα αρχικά στάδια της καρκινικής εξαλλαγής. Από την άλλη πλευρά, η ΡΗ20 εμφάνιζε υψηλότερη έκφραση, σε σχέση με την Hyal1, στα μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα σταδίου Α, η οποία όμως αυξανόταν τέσσερις φορές στα αντίστοιχα καρκινικά, υποδεικνύοντας και τη δική της συμμετοχή στη 10 διαδικασία της αγγειογένεσης. Στα επόμενα στάδια υπήρχε μεν αύξηση στην έκφραση της ΡΗ20, αυτή όμως ήταν μικρή, και πιθανόν να λειτουργεί με σκοπό την ακόμα μεγαλύτερη αποικοδόμηση του υαλουρονικού ώστε να χαλαρώσει η δομή του εξωκυττάριου χώρου και να δοθεί η δυνατότητα ανάπτυξης του καρκίνου ή μετάστασης των καρκινικών κυττάρων. Παράλληλα, διαπιστώθηκε μικρή αύξηση της έκφρασης της ΡΗ20 στα μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα σταδίου Β και πολύ μεγαλύτερη σε εκείνα σταδίου C. Από τον έλεγχο της έκφρασης των συνθασών του υαλουρονικού διαπιστώθηκε ότι υπάρχει σημαντική σταδιο-εξαρτώμενη αύξηση της HAS1, η οποία οδηγεί στη βιοσύνθεση υαλουρονικού μεγάλου μοριακού μεγέθους, υποστηρίζοντας ότι ο καρκίνος συντονίζει την παραγωγή υαλουρονικού με μέγεθος τέτοιο που, σύμφωνα με τις χωροπληρωτικές και ενυδατικές του ιδιότητες, μπορεί να βοηθήσει την ενυδάτωση του εξωκυττάριου χώρου και την κυτταρική ανάπτυξη. Από την άλλη πλευρά, η HAS2 εμφάνιζε μικρή σταδιο-εξαρτώμενη αύξηση, μόνο στα καρκινικά δείγματα, η οποία μπορεί να οδηγήσει στη βιοσύνθεση μεγαλομοριακού υαλουρονικού, που απαιτείται για τη σωστή και οργανωμένη ανάπτυξη του καρκινικού όγκου. Τέλος, η HAS3 εμφάνιζε μικρή σταδιο-εξαρτώμενη μείωση, υποδηλώνοντας ότι η παρουσία της είναι απαραίτητη σε σχεδόν σταθερό βαθμό για την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου και τούτο γιατί το προϊόν της είναι μικρότερου μοριακού μεγέθους σε σχέση με τις υπόλοιπες συνθάσες. Αυτό εξ’ άλλου υποστηρίζεται και από το γεγονός ότι η HAS3 εμφανίζει τη μεγαλύτερη έκφραση σε σχέση με τις άλλες συνθάσες σε δείγματα σταδίου Α, στάδιο που είναι κρίσιμο για την αγγειογένεση και την υποβοήθηση της διατροφής των καρκινικών κυττάρων. Συμπερασματικά, γίνεται φανερό ότι τα καρκινικά κύτταρα συνδυάζουν πολλούς μηχανισμούς για την ανάπτυξη, τη διήθηση και την επέκταση του καρκίνου και τα εξωκυττάρια μακρομόρια μπορεί να έχουν κομβικό ρόλο σ’ αυτούς. Οι μηχανισμοί αυτοί, όπως μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή, είναι: ελεγχόμενη αύξηση της συγκέντρωσης των πρωτεογλυκανών versican και decorin, εξειδικευμένες τροποποιήσεις στη βιοχημική δομή των γλυκοζαμινογλυκανών, ελεγχόμενη έκφραση των βιοσυνθετικών και καταβολικών ενζύμων του υαλουρονικού. Όλες αυτές οι μεταβολές συντονίζονται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να εξυπηρετήσουν τις απαιτήσεις του καρκίνου είτε στο επίπεδο της αγγειογένεσης είτε στο επίπεδο της οργάνωσης του εξωκυττάριου χώρου. Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να προσανατολιστούν ακόμα περισσότερο στη συσχέτιση χημικής δομής και λειτουργικότητας των αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης/δερματάνης, ώστε να γίνουν πλήρως αντιληπτοί οι ρόλοι αυτών των μακρομορίων, όπως επίσης στους ρυθμιστικούς μηχανισμούς που ελέγχουν την έκφραση των ενζύμων του μεταβολισμού του υαλουρονικού, με απώτερο στόχο την ειδικότερη και πληρέστερη φαρμακευτική αντιμετώπιση του καρκίνου.