Η ανοσοκατασταλτική δράση των διαλυτών MHC class-ΙΙ μορίων του ορού σε CD4+ T-λεμφοκύτταρα

Abstract

Soluble MHCII (sMHCII) molecules are present in body fluids of healthy individuals and are considered to be involved in the maintenance of self tolerance, and related to various diseases. Many studies have shown that sMHC molecules play an important role in the physiology of disease but it has not yet been clarified whether they are products of the disease or contribute on its progression. Their concentration increases during in vivo antigen-specific tolerogenic stimulation and it was recently shown that exosome-mediated tolerance is MHCII dependent. At the cellular level, sMHCII proteins compete with membrane MHCII for T-cell receptor binding on CD4+ T cells. Immunoaffinity purification techniques isolated sMHCII antigens from the serum of human serum albumin (HSA)-tolerant mice as a single highly glycosylated protein with a molecular weight of ~60.000, specifically interacting with anti-class II antibodies in Western blotting, ELISA, and acoustic biosensor techniques. Mass spectroscopy analysis showed that these sMHCII proteins were loaded with the tolerogenic peptide as well as multiple self peptides. At the cellular level, sMHCII suppressed antigen-specific, and to a lesser degree antigen-non-specific, spleen cell proliferation in vitro as well as in vivo. Using, acoystic biosensor techniques, we confirmed the interaction between sMHCII molecules and CD4+ T-cells. SMHCII were able to induced CD25 expression in naive T cells and in T cells activated by antigen-seeded macrophages. In addition, sMHCII decreased CD28 and increased CTLA-4 protein expression, while decreasing interleukin-2 and increasing interleukin-10 production. In this case, sMHCII proteins were shown to decrease ZAP-70 and LAT phosphorylation. When we compared different tolerization protocols (different days), we concluded that the tolerization mediaded by cells is a late response of the organism and is possible that soluble factors are produced first. The results presented here for the first time provide evidence for the role of sMHCII proteins in immune response suppression and maintenance of tolerance, revealing novel regulatory mechanisms for immune system manipulation.In conclusion, the present work demonstrated that sMHCII proteins isolated from HSA-tolerant mouse serum exerted antigen-specific as well as antigen-non-specific suppressive effects on CD4+ T cells which are mediated not only by inhibitory marker expression but also by production of suppressive soluble products (i.e. IL-10).

Τα διαλυτά τάξης ΙΙ MHC μόρια (sMHCII) είναι παρόντα στα σωματικά υγρά υγιών ατόμων και θεωρείται πως εμπλέκονται στην διατήρηση της ανοχής σε αντιγόνα του εαυτού αλλά σχετίζονται και με μία σειρά ασθενειών. Από τις μελέτες προκύπτει ότι τα διαλυτά μόρια έχουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των ασθενειών, αλλά δεν έχει ξεκαθαριστεί αν αποτελούν προϊόντα της πάθησης ή αν συνεισφέρουν κάπως στην εξέλιξή της. Η συγκεντρωσή τους αυξάνει κατά την in vivo αντιγονοειδική ανοχογόνα διέγερση και έχει αποδειχθεί σχετικά πρόσφατα πως η ανοχή η οποία μεσολαβείται από εξωσώματα (exosomes) είναι εξαρτώμενη από τάξης ΙΙ MHC μόρια. Σε κυτταρικό επίπεδο, οι διαλυτές τάξης ΙΙ πρωτεΐνες ανταγωνίζονται με τις αντίστοιχες μεμβρανικές για την πρόσδεση στον TCR των CD4+ T-λεμφοκυττάρων.Τα διαλυτά μόρια απομονώνονταν με τεχνικές ανοσοσυγγένειας από ορό ανοχοποιημένων Balb/c ποντικών με την πρωτείνη Human Serum Albumin (HSA). Η πηκτή πολυακρυλαμίδης αποκάλυψε μία μοναδική ζώνη των 60.000Da υψηλά γλυκοζυλιωμένη, η οποία αλληλεπιδρούσε ειδικά με μονοκλωνικό anti-class II αντίσωμα σε στύπωμα κατά Western και τεχνικές ELISΑ. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση επιβεβαιώθηκε και με πειράματα ακουστικών βιοαισθητήρων. Η ανάλυση μετά από τη φασματομετρία μάζας αποκάλυψε πως τα διαλυτά μόρια είναι «φορτωμένα» με ανοχογόνα πεπτίδια καθώς και αντιγονικά πεπτίδια του εαυτού.Σε κυτταρικό επίπεδο, τα διαλυτά τάξης ΙΙ MHC μόρια κατέστειλλαν τον αντιγονοειδικό, και σε μικρότερο βαθμό τoν μη-αντιγονοειδικό πολλαπλασιασμό των σπληνοκυττάρων τόσο in vitro όσο και in vivo ενώ αφού επιβεβαιώσαμε μέσω πειραμάτων ακουστικών βιοαισθητήρων την ειδική αλληλεπίδραση CD4+ T-λεμφοκυττάρων και διαλυτών μορίων, τα τελευταία επήγαγαν την έκφραση του επιφανεικού δείκτη CD25 σε ανώριμα CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα. Επιπλέον, σε CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα, τα οποία είχαν ενεργοποιηθεί από μακροφάγα, τα διαλυτά μόρια μείωσαν την έκφραση του μεμβρανικού δείκτη CD28 και αύξησαν τον μεμβρανικό δείκτη CTLA-4 ενώ ταυτόχρονα μείωσαν την έκκριση της κυτοκίνης IL-2 αυξάνοντας αυτή της κυτοκίνης IL-10. Όσον αφορά τα μονοπάτια σηματοδότησης του TCR, τα διαλυτά μόρια ήταν ικανά να μειώσουν την φωσφορυλίωση των ZAP-70 και LAT κινασών. Η σύγκριση πρωτοκόλλων ανοχοποίησης, διαφορετικών ημερών, υπέδειξε πως η ανοχοποίηση ενός οργανισμού η οποία μεσολαβείται από κύτταρα είναι μια διαδικασία που αργεί και πιθανά στα αρχικά στάδια να μεσολαβείται από διαλυτούς παράγοντεςΤα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ παρέχουν αποδείξεις για το ρόλο των διαλυτών τάξης ΙΙ MHC πρωτεϊνών στην καταστολή ανοσολογικών αποκρίσεων και τη διατήρηση της ανοχής, αποκαλύπτοντας νέους ρυθμιστικούς μηχανισμούς για την διαχείριση του ανοσοποιητικού συστήματος.Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη απέδειξε πως οι διαλυτές τάξης ΙΙ πρωτείνες απομονωμένες από τον ορό ποντικού ανοχοποιημένου για την HSA πρωτείνη μπορούν να επάγουν τόσο ειδικά όσο και μη ειδικά κατασταλτικά γεγονότα στα CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα τα οποία μεσολαβούνται όχι μόνο από την έκφραση επιφανειακών κατασταλτικών δεικτών αλλά και με την παραγωγή κατασταλτικών διαλυτών προιόντων όπως της IL-10.