Ανίχνευση μοριακών διαταραχών σε γυναίκες με πρώιμη ωοθηκική ανεπάρκεια

Abstract

Background: The etiology of premature ovarian insufficiency (POI) is multifactorial and may include genetic and/or environmental factors. Nevertheless, the etiology remains unknown in 90% of the cases, which are classified as idiopathic. Although in ~30% of women with POI the disease has a familiar pattern, in only ~7% a molecular defect has been identified.Αim of the study: The aim of the study was to search for genetic defects in genes related to the development and/or function of the ovary and are linked to POI: FOXL2, BMP15, GDF9, FOXE1 and NOBOX. We hypothesized that causative molecular defects could be identified more frequently in cases with early onset of POI and that analysis of multiple genes in the same population sample could disclose existence of more than one molecular aberration in the same patient.Subjects and Methods: 38 subjects with onset of POI at an early age (mean age 17.4 ± 6.6 years) were included in the study. Bidirectional sequencing of the coding region of FOXL2, FOXE1, BMP15, NOBOX and GDF9 genes was performed. In addition, MLPA was applied in cases in which deletion and/or duplication needed to be excluded. Fifty female subjects from the general Greek population served as controls for the genes FOXL2, BMP15 and NOBOX, and seventy five for the gene FOXE1.Validation of results: The validation of the results was performed by in silico analysis, ab initio 3D protein modeling and by comparing the frequency of the identified genetic variants between patients with POI and controls from the Greek population, as well as, between patients and subjects of the European population of the 1000 Genome Project (1000 GP). Results: In the FOXL2 gene, a novel, de novo, heterozygous deletion (p.K150Rfs*121) was detected in one subject (2.6%). In the FOXE1 gene, a novel aberrant alanine tract was detected with genotype 8/16 in two patients and genotype 8/14 in one patient (normal genotypes: 14/14 or 16/16). Three more patients with aberrant alanine tract were detected with genotypes 12/16, 15/16 and 14/17, respectively. In the control group one individual had a FOXE1 alanine tract with a genotype of 8/14. In the BMP15 gene, the mutation p.Q115H/WT was detected in one subject, in none of our controls or the 1000 GP population. In silico analysis predicted that the mutation p.Q115H was damaging in 5/8 programmes. The mutation p.A180T/WT of the BMP15 gene was detected in 2.6% of the patients, 0% of our control group and 0.5% of the 1000 GP population. In silico analysis predicted that the variant p.A180T was damaging in 2/8 programmes. However, ab initio protein modeling predicted that the p.A180T disrupted the 3D structure of the corresponding BMP15 protein. The genotype c.-9C>G + p.N103S of the BMP15 gene was detected in homozygosity in 5.2% of the patients, 0% of our controls and 0.5% of the 1000 GP population (p: 0.075). All the identified variants in the NOBOX gene were classified as polymorphisms. No missense variants were detected in the GDF9 gene. In five patients, molecular aberrations in two genes in the same subject were identified.Conclusions: Genetic variants in five genes were searched for in patients with relatively early onset of ovarian insufficiency (mean age 17.4 ± 6.6 years). The percentage of genetic variants identified, as possibly related, to the phenotype in our patients with POI was much higher than previously reported (44.7% vs. 7%). The increased incidence of molecular defects in our POI group could be attributed to the younger age of POI onset in our group and the analysis of multiple genes in the same population sample. The existence of genetic aberrations in two genes in five subjects with POI, possibly indicates digenic inheritance, a phenomenon already described in other nosologic entities. The early recognition of genetic defects in women with POI has not only theoretical but also practical interest. The precise etiology of POI can determine more accurately the prognosis, guide the genetic counseling and facilitate planning fertility strategies (cryopreservation).

Γνωσιολογικό Υπόβαθρο: Η αιτιολογία της Πρώιμης Ωοθηκικής Ανεπάρκειας (ΠΩΑ) είναι πολυπαραγοντική και περιλαμβάνει γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Παρά ταύτα, 90% των περιπτώσεων ταξινομούνται ως ιδιοπαθείς. Μολονότι σε ~30% των ασθενών η ΠΩΑ έχει οικογενή κατανομή, μόνο σε ~7% των περιπτώσεων έχουν διαπιστωθεί μοριακές διαταραχές.Σκοπός της μελέτης: Η αναζήτηση μοριακών διαταραχών σε γονίδια που ενέχονται στην οντογένεση και τη λειτουργία της ωοθήκης και έχουν συσχετιστεί με συναφή παθολογία: FOXL2, BMP15, GDF9, FOXE1 και NOBOX. Υποθέσαμε ότι α) η εμφάνιση μοριακής διαταραχής θα ήταν συχνότερη σε άτομα με εκδηλώσεις ΠΩΑ σε νεαρή ηλικία και β) η αναζήτηση μοριακών διαφοροποιήσεων σε περισσότερα του ενός γονιδίου στο ίδιο πληθυσμιακό δείγμα, θα μπορούσε να αναδείξει συνύπαρξη διαφορετικών μοριακών διαταραχών στο ίδιο άτομο.Άτομα που μελετήθηκαν και Μέθοδοι: Σε 38 γυναίκες με κλινική εμφάνιση της ΠΩΑ σε μέση ηλικία 17.4 ± 6.6 έτη, έγινε πλήρης αλληλούχιση των κωδικοποιουσών περιοχών των γονιδίων FOXL2, FOXE1, BMP15, NOBOX και GDF9. Επιπρόσθετα, όπου υπήρχε ένδειξη πιθανής έλλειψης ή διπλασιασμού γονιδίων, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική MLPA. Πενήντα θήλεα άτομα από τον γενικό Ελληνικό πληθυσμό χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες για τα γονίδια FOXL2, BMP15 και NOBOX, ενώ για το γονίδιο FOXE1 χρησιμοποιήθηκαν 75 άτομα.Αξιολόγηση αποτελεσμάτων: Για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε η in silico ανάλυση, η ab initio τρισδιάστατη προτύπωση των πρωτεϊνών καθώς και η σύγκριση της συχνότητας των γενετικών διαφοροποιήσεων (variants) τόσο μεταξύ ασθενών και μαρτύρων της παρούσης μελέτης όσο και μεταξύ ασθενών και ατόμων του Ευρωπαϊκού πληθυσμιακού δείγματος 1000 Genome Project (1000 GP).Αποτελέσματα: Στο γονίδιο FOXL2, διαπιστώθηκε μία νέα (novel), de novo, ετερόζυγη απάλειψη (p.K150Rfs*121) σε μία ασθενή (2.6%). Στο γονίδιο FOXE1, διαπιστώθηκε αλυσίδα αλανινών με γονότυπο 8/16 σε δύο ασθενείς και 8/14 σε μία ασθενή, (φυσιολογικοί γονότυποι 14/14 ή 16/16). Η γενετική αυτή διαφοροποίηση αναφέρεται για πρώτη φορά (novel) στη βιβλιογραφία. Σε τρεις επιπλέον ασθενείς ανιχνεύθηκε αλυσίδα αλανινών με γονότυπους 12/16, 15/16 και 14/17, αντίστοιχα. Ο γονότυπος 15/16 επίσης δεν έχει αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία. Στην ομάδα των μαρτύρων διαπιστώθηκε διαφοροποιημένη αλυσίδα αλανινών με γονότυπο 8/14 σε ένα μόνο άτομο. Στο γονίδιο BMP15, διαπιστώθηκε η μετάλλαξη p.Q115H σε ετεροζυγωτία σε μία ασθενή (2.6%) και σε καμία από τις μάρτυρες της παρούσας μελέτης ή του πληθυσμιακού δείγματος του 1000 GP. Επιπρόσθετα, η in silico ανάλυση της p.Q115H έδειξε ότι είναι επιβλαβής σε 5/8 προγράμματα που χρησιμοποιήθηκαν. Στο γονίδιο BMP15 διαπιστώθηκε επίσης η γενετική διαφοροποίηση p.A180T σε ετερόζυγη μορφή σε 2.6% των ασθενών, 0% στις μάρτυρες και 0.5% στο πληθυσμιακό δείγμα του 1000 GP. Η in silico ανάλυση της p.A180T έδειξε ότι είναι επιβλαβής μόνο σε 2/8 προγράμματα. Εντούτοις, η μετάλλαξη p.A180T προκαλεί σημαντική τροποποίηση του πρωτεϊνικού προτύπου της αντίστοιχης BMP15 πρωτεΐνης. Ο γονότυπος c.-9C>G + p.N103S του γονιδίου BMP15 διαπιστώθηκε σε ομοζυγωτία σε 5.2% των γυναικών με ΠΩΑ έναντι 0% στις μάρτυρες και 0.5% στο πληθυσμιακό δείγμα του 1000 GP (p:0.075). Στο γονίδιο NOBOX διαπιστώθηκαν γενετικές διαφοροποιήσεις που χαρακτηρίστηκαν ως πολυμορφισμοί. Δεν διαπιστώθηκε παρερμηνεύσιμη γενετική διαφοροποίηση στο γονίδιο GDF9. Σε πέντε ασθενείς διαπιστώθηκε ύπαρξη γενετικών διαφοροποιήσεων σχετικών με τον κλινικό φαινότυπο της ΠΩΑ σε περισσότερα του ενός γονιδίου στο ίδιο άτομο.Συμπέρασμα: Γενετικές διαφοροποιήσεις (variants) που πιθανότατα σχετίζονται με τον κλινικό φαινότυπο της ΠΩΑ διαπιστώθηκαν σε 44.7% των ασθενών που μελετήθηκαν. Η αυξημένη συχνότητα γενετικών διαφοροποιήσεων στο πληθυσμιακό μας δείγμα σε σχέση με τα βιβλιογραφικά δεδομένα (~7%) πρέπει να αποδοθεί α) στην μελέτη πολλαπλών γονιδίων και β) στην αναζήτησή τους σε άτομα με εκδήλωση της ΠΩΑ σε νεαρή ηλικία. Η ύπαρξη γενετικών διαφοροποιήσεων σε δύο γονίδια σε πέντε ασθενείς, πιθανώς υποδηλώνει ότι η διγονική κληρονομικότητα ενέχεται στην εκδήλωση της ΠΩΑ, φαινόμενο που έχει παρατηρηθεί και σε άλλες νοσολογικές οντότητες. Η έγκαιρη αναγνώριση γονιδιακής διαταραχής σε άτομα με ΠΩΑ δεν έχει μόνο θεωρητικό αλλά και πρακτικό ενδιαφέρον. Η ακριβής αιτιολόγηση της ΠΩΑ μπορεί να καθορίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια την πρόγνωση, να δώσει δυνατότητα γενετικής συμβουλευτικής και να συμβάλλει στην αντιμετώπιση της αναμενόμενης υπογονιμότητας με κατάψυξη και συντήρηση ωαρίων (cryopreservation).