Ανίχνευση παθογενετικών μηχανισμών που οδηγούν στην πρώιμη ωοθηλακική ωρίμανση: υπάρχει κοινό γενετικό υπόβαθρο στην πρώιμη ωοθηκική ανεπάρκεια και το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών;

Abstract

Premature ovarian insufficiency (POI) is defined as the cessation of menstrual cycles and the loss of ovarian function in women younger than 40 years old. Regardless of its exact etiology, overactivation and early depletion of the primordial follicles is one of the proposed mechanisms leading to POI. Previous studies in genetically modified mice have suggested that certain genes including Foxo3a, FoxL2, PTEN, p27 and AMH suppress primordial follicle activation. Loss of their action results in early depletion of the primordial follicle pool and a phenotype similar to human POI. Likewise, biopsies from PCOS ovaries have shown fewer primordial follicles and an increased number or developing follicles, suggesting an accelerated activation of the primordial follicles. The primary aim of our study was to assess for the first time to our knowledge, the mRNA expression of Foxo3a, FoxL2, PTEN, p27, and AMH and its type II receptor (AMHR2) genes in human cortical ovarian tissue obtained from women with POI compared to healthy women with normal ovarian reserve. We hypothesized that these genes, which inhibit the primordial to primary follicle transition, would be underexpressed in human POI ovaries. The secondary aim of our study was to assess the mRNA expression of the above-mentioned genes in ovarian tissue obtained from women with PCOS compared to healthy controls. Material-Methods: mRNA levels were evaluated by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction and real-time polymerase chain reaction in cortical ovarian tissue obtained from five Caucasian Greek women with POI (n=5), three women with PCOS (n=3) and six healthy women with normal menstruation and a similar age distribution (n=6). The ovarian biopsies were performed during laparoscopic investigation for infertility and planned or acute laparoscopic pelvic surgery for benign disorders. Morphological analysis of the ovarian biopsies was also performed to assess the presence of primordial or other types of growing follicles. All participants gave written informed consent. Results: Ovarian tissue from POI patients showed lower Foxo3a, FoxL2, and p27 mRNA expression compared to healthy controls (p=0.017, p=0.017, and p=0.030, respectively). mRNA expression of AMH, PTEN, and AMHR2 was reduced in ovarian biopsies from POI patients as well. However, these differences were not statistically significant (p=0.143, p=0.247, and p=0.662, respectively). Regarding the ovarian biopsies from women with PCOS, an increased mRNA expression of PTEN was found in these patients compared to controls (p = 0.023). None of the other five genes showed any statistically significant alteration in the mRNA expression. Morphological analysis showed complete lack of follicular structures in all POI biopsies. Conclusion: Our findings suggest a possible role of Foxo3a, FoxL2, and p27 in the pathogenesis of human POI, which may prove to be of great diagnostic-therapeutic value. On the contrary, it is difficult to draw any safe conclusions regarding the gene expression in PCOS patients due to the small sample size. Further larger studies are needed to identify a similar pattern for AMH, PTEN, and AMHR2, assess the expression of these genes in women with PCOS and investigate gene expression at a protein level.

H πρόωρη ωοθηκική ανεπάρκεια (ΠΩΑ) είναι μια ετερογενής διαταραχή που χαρακτηρίζεται από απώλεια της ωοθηκικής λειτουργίας σε γυναίκες νεότερες των 40 ετών. Ανεξάρτητα από το ακριβές αίτιο, η πρώιμη καθολική ενεργοποίηση των αρχέγονων ωοθυλακίων και η επακόλουθη εξάντληση της δεξαμενής τους θεωρείται ένας από του πιθανούς μηχανισμούς πρόκλησης της ΠΩΑ. Πρόσφατες μελέτες σε μοντέλα γενετικά τροποποιημένων ποντικών έδειξαν ότι συγκεκριμένα γονίδια, όπως τα Foxo3a, FoxL2, AMH, p27, PTEN, καταστέλλουν την ωοθυλακική ενεργοποίηση, διατηρώντας τα αρχέγονα ωοθυλάκια σε κατάσταση αδράνειας. Απώλεια της έκφρασης των γονιδίων αυτών στην ωοθήκη knockout μεταλλαγμένων ποντικών επιφέρει καθολική ενεργοποίηση και εξάντληση των αρχέγονων ωοθυλακίων με αποτέλεσμα την ανάπτυξη ενός φαινοτύπου παρόμοιου με την ανθρώπινη ΠΩΑ. Αντίστοιχα, μελέτες σε δείγματα ωοθηκικού ιστού ασθενών με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (ΣΠΩ) έχουν διαπιστώσει μειωμένο αριθμό αρχέγονων ωοθυλακίων και αυξημένο αριθμό αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή μερική αύξηση της ωοθυλακικής ενεργοποίησης. Ο κύριος σκοπός της μελέτης μας ήταν η εκτίμηση, για πρώτη φορά εξ’ όσων γνωρίζουμε στη βιβλιογραφία, της έκφρασης των γονιδίων Foxo3a, FoxL2, p27, PTEN, AMH και του υποδοχέα τύπου ΙΙ της ΑΜΗ (AMHR2) σε επίπεδο mRNA σε ωοθηκικό ιστό γυναικών με ΠΩΑ συγκριτικά με υγιείς μάρτυρες με φυσιολογική εμμηνορρυσία. Υποθέσαμε ότι τα ανωτέρω γονίδια, ως αναστολείς της ενεργοποίησης των αρχέγονων ωοθυλακίων, θα υποεκφράζονται σε ασθενείς με ΠΩΑ. Ο δευτερεύων σκοπός της μελέτης ήταν η εκτίμηση των επιπέδων mRNA των ιδίων γονιδίων σε ωοθηκικό ιστό γυναικών με ΣΠΩ σε σχέση με υγιείς μάρτυρες. Μεθοδολογία: Βιοψία ωοθηκικού ιστού πραγματοποιήθηκε σε πέντε ασθενείς με ΠΩΑ (ορίστηκε ως αμηνόρροια για τουλάχιστον 4 μήνες, υποοιστρογοναιμία και επίπεδα της γοναδοτροπίνης FSH>40 mIU/L σε δύο διαφορετικές μετρήσεις με απόσταση 4 εβδομάδων σε ασθενείς ηλικίας < 40 ετών), τρεις ασθενείς με ΣΠΩ (διάγνωση με βάση τα αναθεωρημένα κριτήρια του Ρότερνταμ) και σε έξι γυναίκες με φυσιολογική εμμηνορρυσία και παρόμοια ηλικιακή κατανομή, οι οποίες αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Η βιοψία έλαβε χώρα κατά τη διάρκεια διαγνωστικής λαπαροσκόπησης για διερεύνηση υπογονιμότητας ή επεμβατικής λαπαροσκόπησης για οξεία κοιλία ή/και καλοήθεις γυναικολογικές παθήσεις. Η γονιδιακή έκφραση σε επίπεδο mRNA μελετήθηκε με τη μέθοδο της ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης (quantitative real-time PCR). Επίσης, πραγματοποιήθηκε μορφολογική ανάλυση των ωοθηκικών βιοψιών, προκειμένου να εξετασθεί η παρουσία αρχέγονων ή άλλων τύπων αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων. Όλες οι ασθενείς έδωσαν έγγραφη συγκατάθεση προκειμένου να συμπεριληφθούν στη μελέτη. Αποτελέσματα: Διαπιστώθηκε μια στατιστικά σημαντική μείωση της mRNA έκφρασης των γονιδίων Foxo3a, FoxL2 και p27 σε ωοθηκικό ιστό ασθενών με ΠΩΑ συγκριτικά με τις γυναίκες της ομάδας ελέγχου (p=0.017, p=0.017 και p=0.030, αντίστοιχα). Η mRNA έκφραση των γονιδίων AMH, PTEN και AMHR2 σε βιοψίες ασθενών με ΠΩΑ ήταν επίσης μειωμένη. Όμως, οι διαφορές αυτές δεν ήταν στατιστικές σημαντικές (p=0.143, p=0.247 και p=0.662, αντίστοιχα). Όσον αφορά τις βιοψίες ασθενών με ΣΠΩ, μόνο για το γονίδιο PTEN ανευρέθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση των mRNA επιπέδων σε σχέση με τις γυναίκες της ομάδας ελέγχου (p = 0.023). Η μορφολογική ανάλυση των ωοθηκικών βιοψιών έδειξε πλήρη έλλειψη ωοθυλακικών δομών στις ασθενείς με ΠΩΑ. Συμπεράσματα: Τα ευρήματα της μελέτης μας υποδηλώνουν ένα πιθανό ρόλο για τα γονίδια Foxo3a, FoxL2 και p27 στην παθογένεση της ανθρώπινης ΠΩΑ, με δυνητικές μελλοντικές διαγνωστικές και θεραπευτικές εφαρμογές. Αντίθετα, λόγω του μικρού αριθμού δειγμάτων, είναι δύσκολο να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα αναφορικά με την έκφραση των εξεταζομένων γονιδίων σε ασθενείς με ΣΠΩ. Αδιαμφισβήτητα, η οριστική επιβεβαίωση της συμμετοχής των εξεταζομένων γονιδίων στους παθογενετικούς μηχανισμούς της ΠΩΑ ή/και του ΣΠΩ απαιτεί μεγαλύτερες σειρές ασθενών, προκειμένου να επαληθευθούν τα αποτελέσματά μας για τις ασθενείς με ΠΩΑ, να εξετασθεί ένα πιθανό παρόμοιο πρότυπο και στις γυναίκες με ΣΠΩ και να διερευνηθεί η γονιδιακή έκφραση σε επίπεδο πρωτεΐνης.