Λειτουργική ικανότητα υπερπληθυσμών λεμφoκυττάρων ασκιτικού υγρού ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών: συσχέτιση με κλινικοπαθολογοανατομικά δεδομένα

Abstract

Human prothymosin alpha (ProTα) is an evolutionary conserved, highly acidic polypeptide of 109 amino acids, with potent immunoenhancing properties in vitro and in vivo. These effects, are attributed to its carboxy (C)-terminal decapeptide, ProTα(100-109).Herein, we investigated the in vitro effect of ProTα and its immunologically active fragment, in synergy with interleukin-2 (IL–2), on the immune responses of lymphocytes isolated from the ascitic fluid of ovarian cancer patients. Hence, lymphocytes isolated from the ascites of 33 untreated ovarian cancer patients (FIGO stage IIIC) were cultured ex vivo in mixed lymphocyte-tumor cultures (MLTC) with ProTα or ProTα(100-109), in synergy with low concentration of IL–2. Cells incubated with low dose IL–2 were used as comparator. Lymphocytes were restimulated weekly, with ascites-derived monocytes and autologous cancer cells for 7-21 days. On days 7, 14 and 21, lymphocytes were tested for their cytotoxicity and their phenotype. Briefly, for the cytotoxicity assays, we used autologous tumor cells as for CD8+T cell targets (MHC-restricted cytotoxicity) and K562 cells as for NK/NKT cell targets (non MHC-restricted cytotoxicity). Targets (T) were labeled with 51Cr and after 18 hours co-incubation with the effectors (E) at an E:T ratio of 40:1, released radioactivity was determined with a γ-counter. For immunophenotype analysis, FITC, PE or PE/Cy labeled anti-CD45, anti-CD56, anti-CD3, anti-CD4 and anti-CD8 mAbs were used. Flow cytometry was conducted on a FACScan (Becton-Dickinson) flow cytometer and data were analyzed using CellQuest. All data were statistically evaluated by paired t-test. p values were two-sided and 5% was chosen to denote significance. SPSS v.13.0 software was used for the analysis. ProTα and its immunoreactive peptide proTα(100-109), enhanced the cytotoxic activity of tumor-associated lymphocytes (TALs), against autologous tumor cells in vitro, ( ~20% vs 12.5%, p = 0.001 for day 7/ ~18% vs 11%, p = 0.003 for day 14) having a less important effect (p = 0.073) on the lysis of NK sensitive targets. The effect of ProTα and ProTα(100-109), was higher during the first 14 days of stimulation. The cytotoxic potential of ProTα(100-109) was found to be at least equal with that of the whole peptide of ProTα. It should be noted that, this is the first report showing the immunoenhancing activity of ProTα/ProTα(100-109) on lymphocytes isolated from ascitic fluids of patients with ovarian cancer. No correlation was mentioned between the aforementioned results and clinical parameters such as patient’s age, tumor histology, grade or response to therapy.Our data demonstrate that, ProTα and ProTα(100-109), can induce the cytotoxic potential of lymphocytes. In the presence of tumor antigens, they enhance the depressed cytotoxicity of TALs against autologous tumor cells in vitro, overturning the effects of a heavily immunosuppressive environment, such as the ascetic fluid of ovarian cancer patients.

Η προθυμοσίνη α (προΤα) είναι ένα ισχυρά όξινο πολυπεπτίδιο, 109 αμινοξικών καταλοίπων, με ανοσοενισχυτική δράση in vitro και in vivo. Οι ανοσοδραστικές της ιδιότητες, οφείλονται στο καρβοξυτελικό της δεκαπεπτίδιο, προΤα(100-109).Στην διατριβή, διερευνήθηκε η in vitro επίδραση των προΤα/προΤα(100-109), συνεργιστικά με ιντερλευκίνη–2, στις ανοσολογικές απαντήσεις λεμφοκυττάρων απομονωμένων από ασκιτικό υγρό ασθενών με καρκίνο ωοθηκών. Απομονωθέντα λεμφοκύτταρα, από 33 ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών σταδίου ΙΙΙC (FIGO), χωρίς προηγούμενη έκθεση σε χημειοθεραπεία, επωάστηκαν ex vivo με προΤα, και προΤα(100–109), συνεργιστικά με χαμηλές συγκεντρώσεις ιντερλευκίνης–2, στα πλαίσια μικτής καλλιέργειας λεμφοκυττάρων/καρκινικών κυττάρων. Ως μέτρο σύγκρισης υπήρξαν κύτταρα που επωάστηκαν παρουσία ιντερλευκίνης–2 μόνο. Τα λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνταν εβδομαδιαία, επί 3 εβδομάδες, με εγχύσεις αυτόλογων καρκινικών κυττάρων. Στις ημέρες 7, 14, 21 γίνονταν έλεγχος του ανοσοφαινότυπου των σχετιζόμενων με τον όγκο λεμφοκυττάρων (TALs) με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής, αλλά και της δραστικότητας τους με τη δοκιμασία κυτταροτοξικότητας. Για τη δοκιμασία της κυτταροτοξικότητας, χρησιμοποιήθηκαν ως στόχοι αυτόλογα καρκινικά κύτταρα και K562 κύτταρα. Οι στόχοι συνδέονταν με 51Cr (18 ώρες συνεπώασης, σε μια αναλογία εκτελεστών : στόχων 40:1), και γίνονταν μέτρηση της εκλυόμενης ραδιενέργειας από μετρητή γ-ακτινοβολίας. Για τον προσδιορισμό του ανοσοφαινότυπου χρησιμοποιήθηκαν anti-CD45, anti-CD56, anti-CD3, anti-CD4 και anti-CD8 μονοκλωνικά αντισώματα συνδεδεμένα με τις χρωστικές φλουορεσκεΐνη, R-φυκοερυθρίνη και R–φυκοερυθρίνη/Cychrome5. Για την κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιήθηκε κυτταρόμετρο BD FACS Calibur. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό CellQuest. Για τη στατιστική επεξεργασία χρησιμοποιήθηκε το paired t–test, με αμφίπλευρα επίπεδα σημαντικότητας και p-value = 0,05. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το SPSS v13.0. Συνολικά, τα πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν πως η προΤα και το προΤα(100-109) ενισχύουν σημαντικά την ειδική – για – το αντιγόνο κυτταροτοξικότητα των TALs, έναντι των αυτόλογων καρκινικών κυττάρων in vitro ( ~20% έναντι 12.5%, p = 0.001 για την ημέρα 7 και ~18% έναντι 11%, p=0.003 για την ημέρα 14), εμφανίζοντας μια λιγότερο ισχυρή επίδραση στην ικανότητα των ΝΚ κυττάρων, να λύουν ευαίσθητους σε αυτά στόχους (p=0.073). Η επίδραση της προθυμοσίνης α και του προΤα(100-109) είναι πιο ισχυρή τις ημέρες 7-14, και μειώνεται σημαντικά την ημέρα 21. Η δράση της προθυμοσίνης α είναι ταυτόσημη με αυτή του προΤα(100-109). Η χρήση δεκαπεπτιδίου με αναδιαταγμένη αλληλουχία αμινοξέων δεν προκάλεσε ανοσοενίσχυση, αποδεικνύοντας έτσι την ειδική για την αλληλουχία δράση του προΤα(100-109). Η συγκεκριμένη μελέτη παρουσιάζει για πρώτη φορά, την ανοσοενισχυτική δράση της προΤα και του προΤα(100-109) σε λεμφοκύτταρα ασκιτικού υγρού ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Δεν υπήρξε κάποια συσχέτιση με την ηλικία, τον ιστολογικό τύπο ή την θεραπευτική ανταπόκριση.Συμπερασματικά, η προθυμοσίνη α και το ανοσοδραστικό καρβοξυτελικό δεκαπεπτίδιο προΤα(100-109), ενισχύουν σημαντικά την λυτική ικανότητα των TALs. Παρουσία καρκινικών αντιγόνων, ενισχύουν την μειωμένη κυτταροτοξικότητα των TALs έναντι των αυτόλογων καρκινικών κυττάρων, αναστρέφοντας την ισχυρή ανοσοκατασταλτική επίδραση που ασκεί σε αυτά, το περιβάλλον του ασκίτη ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών.