Oil spills bioremediation in marine environment: biofilm characterization around oil droplets

Abstract

Major oil spills highlight the need for environmentally responsible and cost-effective mitigation technologies such as bioremediation through bioaugmentation (addition of oil-degrading bacteria) and/or biostimulation (addition of nutrients N&P). The specific aims of the present work were to investigate possible methods to enhance the rate of biodegradation of oil in a contaminated marine environment (both seawater and shoreline). Hence we investigated the capability of either acclimated indigenous microbial consortium or hydrocarbon degraders consortium enriched from seawater samples taken from Hellenic Petroleum Refinery (Athens, Greece) a site exposed to chronic pollution with crude oil (ABA) in the presence or absence of other rate limiting factors like nutrients and biosurfactants (biostimulation) as a potential strategy for the successful remediation of polluted marine environments. In addition the effectiveness of these certain acclimated consortia (ABA) was compared to indigenous population activity (biostimulation) on the bioremediation of oil spills. Specifically the effects of the lipophilic nutrients (uric acid and lecithin) and inorganic nutrients (KNO3, K2HPO4) with or without biosurfactants on the degradation of crude oil hydrocarbons in both seawater and sand matrix were also examined. While bioremediation in liquid matrices (seawater) is implemented in a more direct way, in the soil matrix (sand) is achieved through landfarming which is both simple and cost-effective to implement compared with other treatment technologies.Thus the outcome approaches include 4 sets of experiments:1.Autochthonous bioaugmentation and/or biostimulation of seawater microcosm (i.e. Seawater 1)2.Autochthonous bioaugmentation & biostimulation with isolated hydrocarbon degraders consortium of seawater microcosm (i.e. Seawater 2)3.Landfarming of oil polluted beach sand through biostimulation (i.e. Sand 1)4.Landfarming of oil polluted beach sand through autochthonous bioaugmentation & biostimulation (i.e. Sand 2)The method which has been used for the evaluation of these bioremediation methods is based on a modified bioremediation agent effectiveness testing protocol by EPA (40 CFR Ch. I, Pt 300, App. C, 2003). The protocol tests for microbial activity by Most Probable Number (MPN) determination and quantifies the disappearance of saturated hydrocarbons and polynuclear aromatic hydrocarbons (PAHs) by GC-MS analysis. Moreover the disappearance extent (degradation rate) of certain compounds from both saturated fraction (n-alkanes) and aromatic fraction (PAHs was also investigated through biodegradation kinetics analysis (Batch reactor). Furthermore identification of the key microorganisms in oil biodegradation community response and composition changes among different amendments was also performed through molecular analysis (PCR, RT-PCR, pyrotag Sequencing) of DNA extracts from each treatment. Moreover the interaction between oil and microorganisms was investigated in another set of experiments by means of confocal laser scanning microscopy (CLSM). Additionally their response after the addition of certain commercial dispersants just like those that have been or could be used in the event of a real oil spill (Corexit, S200, Marichem) but also of more environmentally friendly biosurfactants (Rhamnolipids) was also examined.Combined application of Rhamnolipids and lipophilic nutrients could be beneficial in liquid matrix (seawater) compared to when applied to solid matrix (sand). On the contrary inorganic nutrients usually being washed out when applied in seawater perform better when applied to sand almost equally to ULR combined performance. Still overall ULR treatment performance suggests that the presence of biosurfactant could possibly have contributed to utilization of lipophilic nutrients by making them more available to soil microorganisms.CLSM investigation has revealed that bacteria of mixed consortia are organized into clusters forming strings, star and grape like shapes of bacteria and fine oil droplets bridging each other possibly with EPS. This new organization and structure between oil and microbial consortia has brought up a new perspective-mechanism in which mixed consortia utilize oil hydrocarbons and could provide a new dimension for the study of coaggregation and biofilm microbial communities in the marine ecosystem. Moreover understanding the interactions between oil-degrading microorganisms is essential, not only when predicting the fate of hydrocarbons in the environment but also for the development of new improved surfactants formulations or biosurfactans that can be used under different environmental conditions.This work has demonstrated that in the absence of essential nutrients, inoculation only with autochthonous hydrocarbon degraders is not an effective treatment, however when the needed nutrients or other biostimulants are supplemented the advantages of such combination are obvious and result in accelerated hydrocarbon consumption by the added autochthonous consortium. Thus we strongly believe that the combination of autochthonous bioaugmentation and biostimulation is a promising strategy to speed up bioremediation in cases where there is lack of both nutrients and indigenous degraders. This technique has a number of advantages like shorter treatment time, greater potential efficiency, lower impact on the environment, and relative ease in obtaining public support. Thus future research that would define the carrying capacities of various environments and the mechanisms that control them could be fruitful in this regard.

Οι θαλάσσιες πετρελαιοκηλίδες αποτελούν απειλή και επιτάσσουν την ανάγκη να βρεθούν και να εξεταστούν νέοι αποτελεσματικότεροι, πιο φιλικοί περιβαλλοντικά και πιο οικονομικοί τρόποι –μέθοδοι αποκατάστασης και αντιμετώπισης ενός θαλάσσιου περιβάλλοντος ρυπασμένου με πετρελαιοειδή όπως είναι η βιοεξυγίανση μέσω της βιοενίσχυσης (προσθήκη βακτηρίων που αποδομούν το πετρέλαιο) και της βιοδιέγερσης (προσθήκη θρεπτικών N&P ή άλλων περιοριστικών παραγόντων). Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να μελετηθούν πιθανές μέθοδοι που θα ενίσχυαν τον ρυθμό βιοαποδόμησης του πετρελαίου στο ρυπασμένο θαλάσσιο περιβάλλον (ανοιχτής θαλάσσης και παράκτιο) μειώνοντας έτσι τον χρόνο που απαιτείται για να αποκατασταθεί. Ως εκ τουτου εξετάστηκε η ικανότητα δυο κονσόρτσια ειτε με εγκλιματισμένους (σε συνθήκες ρυπασμένης θαλάσσης με πετρέλαιο) αυτόχθονες θαλάσσιους μικροοργανισμούς ειτε με απομονωμένους μικροοργανισμούς (ΕΛΠΕ, Αθήνα) που αποδομούν πετρελαϊκούς υδρογονάνθρακες (αυτόχθονη βιοενίσχυση - ABA) ως επιτυχής στρατηγική στην εξυγίανση ρυπασμένου θαλάσσιου περιβάλλοντος παρουσία ή μη άλλων περιοριστικών παραγόντων όπως θρεπτικά οι βιογενείς επιφανειοδραστικές ενώσεις- biosurfactants (βιοδιέγερση). Οι αποδομητές πετρελαίου προήλθαν από διαδοχικούς εμπλουτισμούς και απομονώσεις θαλάσσιων δειγμάτων νερού που συλλέχθηκαν από την περιοχή του κόλπου της Ελευσίνας κοντά στα διυλιστήρια των Ελληνικών Πετρελαίων (ΕΛΠΕ), μια περιοχή που εκτίθεται σε χρόνια ρύπανση από πετρελαιοειδή. Επιπλέον η ικανότητα των κονσόρτσια με τους ηδη προσαρμοσμένους αποδομητές πετρελαίου (ABA) αντιπαρατεθηκε με την ικανότητα των αυτόχθονων μικροοργανισμών (βιοδιέγερση) να αποδομήσουν τους πετρελαικούς υδρογονάνθρακες. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η επίδραση λιπόφιλων οργανικών θρεπτικών (ουρικό οξύ- uric acid, λεκιθίνη-lecithin) και ανόργανων θρεπτικών (KNO3 και K2HPO4,-NPK treatment) παρουσία ή μη βιογενών επιφανειοδραστικών ενώσεων- biosurfactants στην βιοαποδόμηση πετρελαικών υδρογονανθράκων τοσο σε περιβάλλον ανοιχτής θαλάσσης όσο και σε παράκτιο. Ενώ λοιπόν η βιοξυγίανση των πετρελαιοκηλίδων στο θαλασσινό νερό (υγρή μήτρα) αντιμετωπίζεται με άμεσο τρόπο, στο παράκτιο περιβάλλον (στερεή μήτρα) προσεγγίζεται μέσω της τεχνικής αποκατάστασης ρυπασμένων εδαφών γνωστή ως «τεχνική επεξεργασίας στερεάς φάσης»-landfarming, η οποία είναι παράλληλα απλή και χαμηλού κόστους συγκρινόμενη με άλλες τεχνικές αποκατάστασης ρυπασμένων εδαφών.Ετσι προέκυψαν 4 σειρές πειραμάτων και περιλαμβάνουν:1.Αυτόχθονη βιοενίσχυση και/ή βιοδιέγερση σε θαλάσσιο μικρόκοσμο (π.χ. Seawater 1)2.Αυτόχθονη βιοενίσχυση & βιοδιέγερση με κονσόρτσια απομονωμένων μικροοργανισμών που αποδομούν τους πετρελαικούς υδρογονάνθρακες σε θαλάσσιο μικρόκοσμο (π.χ. Seawater 2)3.Βιοδιέγερση σε ρυπασμένη με πετρέλαιο άμμο μέσω της τεχνικής landfarming (π.χ. Sand 1)4.Αυτόχθονη βιοενίσχυση & βιοδιέγερση σε ρυπασμένη με πετρέλαιο άμμο μέσω της τεχνικής landfarming (π.χ. Sand 2)Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση των παραγόντων βιοεξυγίανσης βασίζεται στο τροποποιημένο πρωτόκολλο δοκιμής της αποτελεσματικότητας των παραγόντων βιοεξυγίανσης της EPA (40 CFR Ch. I, Pt 300, App. C, 2003). Το πρωτόκολλο εξετάζει τη μικροβιακή δραστηριότητα με την Ανάλυση του πιο Πιθανού Αριθμού (Most Propable Number) και ποσοτικοποιεί την απομάκρυνση των κορεσμένων υδρογονανθράκων και των πολυαρωματικών αρωματικών υδρογονανθράκων (PAHs) με τη χρήση GC-MS. Επιπρόσθετα ο βαθμός απομάκρυνσης (ρυθμός αποδόμησης) επιλεγμένων συστατικών και από τα δυο κλάσματα των κορεσμένων (ν-αλκάνια) και των αρωματικών (PAHs) εξετάστηκε μέσω βιοχημικής κινητικής ανάλυσης λαμβάνοντας υπόψη τις αρχές που διέπουν βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου (Batch reactor). Ενώ η ταυτοποίηση των μικροοργανισμών που αποδομούν τους πετρελαϊκούς υδρογονάνθρακες, καθώς και η απόκριση και αλλαγή της δομής των κονσόρτσια που χρησιμοποιήθηκαν μεταξύ των διαφορετικών πειραμάτων αλλά και επεξεργασιών επιτεύχθηκε με μοριακή ανάλυση (PCR, RT-PCR, pyrotag Sequencing) δειγμάτων γενετικού υλικού που ελήφθησαν από κάθε επεξεργασία. Επιπλέον εξετάστηκε η αλληλεπίδραση των μικροοργανισμών με το πετρέλαιο σε μια ακόμη σειρά πειραμάτων με τη χρήση μικροσκοπίας ομοεστιακής δέσμης λέιζερ (confocal microscopy- CLSM). Επιπρόσθετα εξετάστηκε η απόκριση τους μετά την προσθήκη των εμπορικών διασκορπιστικών ενώσεων (Corexit, S200 και Marichem) αλλά και της βιογενούς επιφανειοδραστικής ένωσης-biosurfactant (ραμνολιπίδια-rhamnolipids).Η συνδυασμένη εφαρμογή ραμνολιπιδίων και λιπόφιλων θρεπτικών είναι αρκετά επωφελής σε υγρή μήτρα (θαλασσινό νερό) παρά σε στερεή μήτρα (άμμος). Εν αντιθέσει τα ανόργανα θρεπτικά παρότι εκπλένονται γρήγορα στο θαλασσινό νερό αποδίδουν πολύ καλύτερα όταν εφαρμοστούν σε αμμώδη ακτή, εξίσου αποδοτικά με το ULR (ραμνολιπίδια - λιπόφιλα θρεπτικά) συνδυασμό. Πάραυτα η συνολική εικόνα της επεξεργασίας ULR δείχνει ότι η παρουσία βιογενών επιφανειοδραστικών ενώσεων συνεισέφερε στην χρησιμοποίηση των λιπόφιλων θρεπτικών αυξάνοντας τη βιοδιαθεσιμότητα τους προς τους μικροργανισμούς που βρίσκονται στην άμμο.Η παρατήρηση με μικροσκόπιο CLSM απεκάλυψε ότι οι μικροοργανισμοί οργανώνονται σε συμπλέγματα μεταξύ τους και με τα διασκορπισμένα σταγονίδια πετρελαίου σχηματίζοντας πολύπλοκες δομές τύπου σταφυλιού και αστερία (grape style shapes- star-like patterns) οι οποίες ενώνονται μεταξύ τους με γέφυρες από βακτήρια και πιθανώς με βιοπολυμερή όπως είναι οι εξωκυτταρικοί πολυσακχαρίτες (EPS). Η νέα αυτή οργάνωση και δομή που παρατηρείται μεταξύ των μεικτών κονσόρτσια και του πετρελαίου δημιούργησε μια νέα προοπτική-μηχανισμό με τον οποίο τα μικτά κονσόρτσια χρησιμοποιούν τους υδρογονάνθρακες πετρελαίου και θα μπορούσε να προσφέρει μια νέα διάσταση για τη μελέτη των μικροβιακών κοινοτήτων που οργανώνονται σε συσσωματώματα και βιοστιβάδες στο θαλάσσιο οικοσύστημα. Επιπλέων η κατανόηση των βασικών μηχανισμών αλληλεπίδρασης μεταξύ μικροοργανισμών και ρυπαντή (πετρελαιοειδή) μπορεί να βοηθήσει στην πρόβλεψη όχι μόνο της τύχης του πετρελαίου στο περιβάλλον αλλά και να συντελέσει στην δημιουργία βελτιωμένων διασκορπιστικών ουσιών ή βιογενών επιφανειοδραστικών ενώσεων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν κάτω από διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες.Συγκεκριμένα η παραπάνω διερεύνηση απέδειξε ότι απουσία στοιχειωδών θρεπτικών, ο εμβολιασμός μονάχα με πληθυσμό αυτόχθονων μικροοργανισμών ικανών να αποδομήσουν τους πετρελαϊκούς υδρογονάνθρακες δεν θεωρείται επαρκής. Ωστόσο ο συνδυασμός απαραίτητων θρεπτικών ή άλλων περιοριστικών παραγόντων (π.χ. ραμνολιπίδια) μαζί με τον αυτόχθονο πληθυσμό των αποδομητών υδρογοναθράκων πλεονεκτεί με αποτέλεσμα την αυξημένη κατανάλωση των υδρογονανθράκων από τον πληθυσμό αυτόχθονων μικροοργανισμών που προστέθηκε. Έτσι λοιπόν πιστεύουμε ότι ο συνδυασμός αυτόχθονης βιοενίσχυσης και βιοδιέγερσης μπορεί να αποτελέσει μελλοντική στρατηγική που θα μπορούσε να επιταχύνει την βιοαποδόμηση σε περιπτώσεις όπου υπάρχει έλλειψη θρεπτικών και μικροοργανισμών. Η τεχνική αυτή παρουσιάζει μια σειρά πλεονεκτημάτων όπως μικρότερο χρόνο επεξεργασίας, μεγαλύτερη αποδοτικότητα, μικρότερη όχληση στο περιβάλλον και τυγχάνει σχετικά εύκολα δημόσιας αποδοχής. Έτσι λοιπόν η μελλοντική έρευνα που θα καθορίσει τη φέρουσα ικανότητα των διάφορων περιβαλλόντων και των μηχανισμών που τους ελέγχουν θα μπορούσε να είναι αρκετα εποικοδομητική στην εν προκειμένω προσέγγιση.