Βιολογικές δράσεις αρωματικών-φαρμακευτικών φυτών

Abstract

In the present thesis we studied specific biological effects (anticancer, plant protectant) of some aromatic and medicinal plants that were chosen from the wild grown flora in the region of Epirus. At first the possible anticancer activity of the selected plant species was investigated on cancer cell line A549 that was used as a model. The type of cell death (apoptosis - necrosis) was investigated by biochemical and morphological criteria. The extracts that showed anticancer activity were evaluated. The selected extracts were studied for their selectivity after influence on lung fibroblasts. One of the aromatic plants that showed interest for its apoptotic activity on cancer cells A549, was analyzed chromatographically (GC-MS, DHS-GC-MS) and studied for its antifungal activity on three phytopathogenic fungi which infect tomatoes or tomato plants.Particular interest for its anticancer activity showed the methanol extract of Helleborus cyclophyllus leaves which is a medicinal plant that induces apoptosis on cancer cells A549 while it doesn’t affect normal cells of lung (lung fibroblasts). The extract of H. cyclophyllus leaves was found to cause exocytosis and vesicle formation (ectosomes), detachment of cancer cells A549 from their substrate, formation of a large vesicle into the cytoplasm like structures known as thanatosomata and finally induction of apoptosis. Until today there is not known a substance which causes the above mentioned phenomena and leads to selective apoptosis of cancer cells. The reduced levels of prokaspase -3 and the cleavage of PARP (0.1, 0.6 mg/mL) that was found by Western blot confirm the apoptotic activity of the extract.From the aromatic plants of Lamiaceae family that were tested for their bioactivity on cancer cells A549 particular interest showed the species Satureja horvatii ssp. macrophylla. According to the results of flow cytometry the extract that was used in bioassays induces apoptosis and causes necrosis on epithelial lung cancer cells A549. As it has been found by gas chromatographic analysis the essential oil (GC-MS) of S. horvatii ssp. macrophylla that was used for the bioassays belongs to the carvacrol chemotype (42-48%). The antifungal activity of the essential oil was studied against Botrytis cinereae, Alternaria alternata which are phytopathogenig fungi that infect plants during their growth, cause post harvest diseases on tomatoes and on Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, which is a soil-borne phytopathogenic fungus which causes tomato wilt.The results showed that for all the phytopathogenig fungi tested, the essential oil of S. horvatii ssp. macrophylla was highly effective. The action of the essential oil was fungistatic for all the tested concentrations. Of the greatest interest was the fumigant action compared to the contact action. The minimum inhibitory concentration of mycelium growth (MIC) was 123 μL/L air for F. oxysporum f. sp. lycopersici and 100 μL/ L for A. alternata.

Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν συγκεκριμένες βιολογικές δράσεις (αντικαρκινική, φυτοπροστατευτική) ορισμένων αρωματικών – φαρμακευτικών φυτών που επιλέχθηκαν από την αυτοφυή χλωρίδα της Ηπείρου. Αρχικά διερευνήθηκε η πιθανή αντικαρκινική δράση των επιλεγμένων φυτικών ειδών στην Α549 καρκινική κυτταρική σειρά, η οποία χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο. Ο τύπος του κυτταρικού θανάτου (απόπτωση – νέκρωση) μελετήθηκε με βιοχημικά και μορφολογικά κριτήρια. Τα εκχυλίσματα που παρουσίασαν ενδιαφέρον για την αντικαρκινική τους δράση αξιολογήθηκαν. Εκείνα που επιλέχθηκαν μελετήθηκαν για την εκλεκτικότητα της δράσης τους, έπειτα από επίδρασή τους σε πνευμονικούς ινοβλάστες. Ένα από τα αρωματικά φυτά που παρουσίασε ενδιαφέρον για την αποπτωτική του δράση στα Α549 καρκινικά κύτταρα, αναλύθηκε χρωματογραφικά (GC-MS, DHS-GC-MS) και μελετήθηκε για την αντιμυκητική του δράση σε τρία φυτοπαθογόνα είδη μυκήτων που προσβάλουν την τομάτα.Ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την αντικαρκινική του δράση παρουσίασε τo μεθανολικό εκχύλισμα φύλλων του φαρμακευτικού φυτού Helleborus cyclophyllus, το οποίο, όπως διαπιστώθηκε επάγει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων, ενώ δεν επηρεάζει τα φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα (πνευμονικούς ινοβλάστες). Το εκχύλισμα φύλλων του H. cyclophyllus διαπιστώθηκε, ότι προκαλεί εξωκυττάρωση και σχηματισμό κυστιδίων (ectosomes), αποκόλληση των Α549 καρκινικών κυττάρων από το υπόστρωμά τους, σχηματισμό ενός μεγάλου σε μέγεθος κυστιδίου εντός του κυτταροπλάσματος που μοιάζει με δομές γνωστές ως θανατοσώματα και τέλος επάγει την απόπτωσή τους. Μέχρι σήμερα δεν είναι γνωστή κάποια ουσία που να προκαλεί τα προαναφερόμενα φαινόμενα και να οδηγεί σε επιλεκτική απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Τα μειωμένα επίπεδα της προκασπάσης -3 και η διάσπαση της PARP (0.1, 0.6 mg/ mL) που διαπιστώθηκαν με ανοσοαπωτύπωση κατά Western blot επιβεβαιώνουν την αποπτωτική δράση του εκχυλίσματος.Από τα αρωματικά φυτά της οικογένειας Lamiaceae ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασε το είδος Satureja horvatii ssp. macrophylla. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της κυτταρομετρίας ροής το εκχύλισμα που χρησιμοποιήθηκε στις βιοδοκιμές ενεργοποιεί την απόπτωση και προκαλεί νέκρωση στα Α549 επιθήλια καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Όπως διαπιστώθηκε από την αέριο χρωματογραφική ανάλυση του αιθέριου ελαίου (GC-MS) το S. horvatii ssp. macrophylla που χρησιμοποιήθηκε στις βιοδοκιμές ανήκει στον χημειότυπο της καρβακρόλης (42-48%). Η αντιμυκητική δράση του αιθέριου ελαίου μελετήθηκε για τα είδη Botrytis cinereae, Alternaria alternata που προκαλούν, εκτός των άλλων, μετασυλλεκτικές σήψεις σε καρπούς τομάτας και το είδος Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, το οποίο είναι ένα εδαφογενές φυτοπαθογόνο που προκαλεί αδρομύκωση στα φυτά της τομάτας.Από τα αποτελέσματα των βιοδοκιμών στα 3 φυτοπαθογόνα είδη διαπιστώθηκε, ότι το αιθέριο έλαιο του S. horvatii ssp. macrophylla ήταν ιδιαίτερα δραστικό. Για όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν η δράση του αιθέριου ελαίου ήταν μυκοστατική, ενώ μεγαλύτερο ενδιαφέρον παρουσίασε η υποκαπνιστική δράση του αιθέριου ελαίου συγκριτικά με την δράση εξ΄ επαφής. Η ελάχιστη συγκέντρωση αναστολής της μυκηλιακής ανάπτυξη (MIC) υπολογίστηκε σε 123 μL/ L αέρα για το F. oxysporum f. sp. lycopersici και σε 100 μL/ L για το A. alternata.