Ο ρόλος της αλδεϋδικής αφυδρογονάσης 3Α1 (ALDH3A1) στην κυτταρική ομοιόσταση του κερατοειδούς

Abstract

Aldehyde dehydrogenase 3A1 (ALDH3A1) is an NAD(P)+-dependent enzyme, which oxidizes certain aldehydes to their corresponding acids. It is constitutively expressed in a taxon-specific manner in the cornea, where its expression reaches up to 50% of the water soluble proteins in some species. Because ALDH3A1 is highly abundant in this tissue, it has been suggested to be a corneal crystallin with functions that go beyond a pure metabolic role. The present study aimed to examine the mechanisms by which ALDH3A1 exerts its cytoprotective functions in the cornea. It was focused on exploring its potential chaperone-like activity and the molecular mechanisms through which it exerts its anti-oxidant function as well as identifying potential ALDH3A1-protein interactions. Following specific strategies, we expressed the recombinant human ALDH3A1 in E. coli tagged with either maltose binding protein (MBP) or 6-histidines (6xHis) and showed that ALDH3A1 possesses chaperone-like activity both in vitro and in vivo. The recombinant ALDH3A1 was capable of protecting a variety of model proteins from aggregation and/or inactivation under UVB-induced and thermal stress conditions in vitro. Furthermore, the ALDH3A1-expressing E. coli cells exhibited enhanced tolerance under thermal stress conditions compared to non-expressing cells. For examining the anti-oxidant role of ALDH3A1, we established an isogenic HCE-2 (human corneal epithelium) cell line pair. ALDH3A1-expressing HCE-2 cells exhibited significantly slower growth rates and enhanced resistance to the genotoxic and cytotoxic effects of various oxidants (H2O2, VP-16) compared to mock transfected cells. The anti-oxidant effect of ALDH3A1 was accompanied by constitutive phosphorylation of H2AX at basal levels, and enhanced phosphorylation of H2AX, after treatment with H2O2, in the ALDH3A1/HCE-2 cells. Interestingly, real-time PCR revealed that ALDH3A1 significantly altered the expression profile of a variety of DNA damage response (DDR) related genes including genes of the ATM/ATR signaling cascade along with cell cycle regulation and DNA damage repair genes. For example, the BRCA1, FEN1, and MAPK12 exhibited significant up-regulation, while the CDKN1A (p21) was found to be down-regulated both at basal levels and after treatment with H2O2. Additionally, the cell survival advantage associated with ALDH3A1 expression was also validated in breast cancer cells (MCF-7). Finally, phage display revealed a variety of proteins that could interact with ALDH3A1. Amongst them are proteins with significant biological interest such as transcriptional factors (SOX-30, GLIS1), cell cycle regulators (Cyclin-Y-like protein, C15orf42, tribbles homolog 2) and stress related proteins (heat shock protein beta-1). The results of the phage display assay require further validation and constitute particularly useful data for future analysis. In conclusion, this study suggests that ALDH3A1 significantly contributes to cellular homeostasis through a variety of functions. Further studies would shed light on the precise roles of this multifunctional protein.

Η αλδεϋδική αφυδρογονάση 3Α1 (ALDH3A1) είναι ένα NAD(P)+-εξαρτώμενο ένζυμο, το οποίο οξειδώνει διάφορες αλδεΰδες στα αντίστοιχα καρβοξυλικά τους οξέα. Στον κερατοειδή, η ALDH3A1 εκφράζεται με ταξο-ειδικό τρόπο και σε εξαιρετικά υψηλά ποσοστά στα θηλαστικά, φτάνοντας έως και το 50% των υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών σε κάποια είδη. Λόγω του υψηλού ποσοστού έκφρασής της στον ιστό, η ALDH3A1 έχει χαρακτηριστεί ως κρυσταλλίνη και θεωρηθείται πως επιτελεί επιπλέον λειτουργίες πέραν του ενζυμικού της ρόλου. Ο στόχος της έρευνάς μας ήταν να διελευκάνουμε τον πιθανό ρόλο της ALDH3A1 ως μοριακού συνοδού, τους μηχανισμούς μέσω των οποίων επιτυγχάνει την αντι-οξειδωτική της δράση, αλλά και να αναγνωριστούν οι πιθανές πρωτεϊνικές της αλληλεπιδράσεις. Για τον λόγο αυτό προχωρήσαμε στην ετερόλογη έκφραση της ALDH3A1 σε E.coli. Συγκεκριμένα, εκφράστηκε σημαντική ποσότητα διαλυτής ALDH3A1 ως χιμαιρική με την πρωτεΐνη πρόσδεσης της μαλτόζης (MBP) μειώνοντας την θερμοκρασία επαγωγής στους 25°C. Επίσης, έκφραση της ALDH3A1 ως χιμαιρικής με το εξαπεπτίδιο ιστιδινών (6xHis) οδήγησε σε μικρή διαλυτότητα, κάτι το οποίο επιλύθηκε μέσω της συν-έκφρασης των μοριακών συνοδών GroES/GroEL και dnaK/dnaJ/GrpE. Η ανασυνδυασμένη ALDH3A1 στην συνέχεια χρησιμοποιήθηκε σε μελέτες δραστικότητας μοριακού συνοδού. Παρουσία της ALDH3A1 απετράπη η κατακρήμνιση ή/και η απενεργοποίηση διάφορων μοντέλων-πρωτεϊνών υπό συνθήκες θερμικού και UVΒ επαγόμενου στρες. Επιπλέον, μετασχηματισμένα E. coli βακτήρια που εκφράζουν την ανθρώπινη ALDH3A1, εμφάνισαν αυξημένη αντοχή σε συνθήκες θερμικού στρες σε σύγκριση με τα βακτήρια-μάρτυρες. Για την μελέτη του ρόλου της ALDH3A1 προχωρήσαμε στην δημιουργία ενός ισογονιδιακού ζεύγους HCE-2 κυτταρικών σειρών το οποίο διέφερε μόνο στην έκφραση της ALDH3A1. Τα ALDH3A1/HCE-2 κύτταρα παρουσίασαν μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης σε σχέση με τα mock/HCE-2. Επιπλέον, η ALDH3A1 προστατεύσε τα HCE-2 κύτταρα τόσο από τις κυτταροτοξικές, όσο και από τις γενοτοξικές επιδράσεις διαφόρων οξειδωτικών παραγόντων (H2O2, VP-16). Η προστατευτική δράση της ALDH3A1 συνοδευόταν από ιδιοστατική φωσφορυλίωση της ιστόνης H2AΧ σε βασικά επίπεδα και αυξημένη φωσφορυλίωσή της σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Επιπλέον, μελέτη της έκφρασης γονιδίων σχετιζόμενων με την κυτταρική απόκριση σε βλάβες του DNA αποκάλυψε πως οι δύο ισογονιδιακές σειρές HCE-2 παρουσιάζουν ένα σημαντικά διαφορετικό προφίλ έκφρασης, τόσο σε βασικά επίπεδα, όσο και υπό συνθήκες οξειδωτικού στρες. Συγκεκριμένα, τα γονίδια BRCA1, FEN1 και MAPK12 παρουσίασαν σημαντική υπερ-έκφραση, ενώ το γονίδιο CDKN1A (p21) βρέθηκε υπό-εκφρασμένο στα ALDH3A1/HCE-2 σε σύγκριση με τα mock/HCE-2 κύτταρα. Το πλεονέκτημα επιβίωσης σχετιζόμενο με την έκφραση της ALDH3A1 φάνηκε μάλιστα να επεκτείνεται και στην περίπτωση καρκινικών κυττάρων μαστού (MCF-7). Τέλος, εφαρμόζοντας τη τεχνική σάρωσης βιβλιοθήκης φάγων υποδείχθηκαν πιθανές πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις με την ALDH3A1. Ιδιαίτερο βιολογικό ενδιαφέρον παρουσιάζουν πρωτεΐνες όπως οι: SOX-30, GLIS1, Cyclin-Y-like protein, C15orf42, tribbles homolog 2 και heat shock protein beta-1. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της έρευνας αυτής συντελούν στην σύνθεση της εικόνας της ALDH3A1 ως μια πολυπαραγοντική πρωτεΐνη που συμβάλει σημαντικά στην κυτταρική ομοιόσταση μέσω μιας πληθώρας λειτουργιών, ορισμένες από τις οποίες ήταν μέχρι στιγμής ανεπιβεβαίωτες ή ακόμη και άγνωστες.