Βιογένεση πρωτεϊνών και οξειδωτική αναδίπλωση στα μιτοχόνδρια

Abstract

The biogenesis of mitochondria is based on specific pathways for targeting andimport, as most proteins are synthesized in the cytoplasm and subsequently enter thedifferent compartments. The discovery of the oxidative folding pathway inmitochondria, MIA, in 2004 was a turning point in the history of these organelles.Following studies have focused mainly on the small typical substrates of the pathwayand the interactions of the two central partners, the redox controlled receptor Mia40and the sulfydryl-oxidase Erv1. Great progress has been made in the recent years, asthe list of the proteins that utilize the pathway is constantly expanding with larger andmore complex substrates, including Mia40 itself.In this work, we studied three different proteins and their function in themitochondrial intermembrane space. In the first chapter, we focused on theoxidoreductase Mia40, its characteristics as a substrate and dissected precisely thestages of its biogenesis in yeast. Our results illustrate a coordinated sequence ofevents, and are summarized with import of the Mia40 precursor into mitochondriaanchored into the inner membrane translocase, interaction with the endogenous activeMia40 for folding of the structural core of the molecule and finally oxidation of thecatalytic center by Erv1. These two kinetically distinct interactions are based oncompletely different determinants with Mia40 presenting an atypical behaviorcompared to other substrates that utilize the mitochondrial oxidative pathway.The second chapter describes the study of the peroxidase Gpx3 in the intermembranespace. It was already known that this protein acts in the cytosol as a sensor for redoxstress and signal transducer for the response against it. Recently, it was shown that itcan also be located in the intermembrane space of mitochondria without evidence orany description of the conditions that lead to this localization. Our results suggest thatmitochondria host a putative redox regulation pathway with Gpx3 as the keycomponent.For this study, we evaluated protein interactions focusing mainly on the receptor ofthis compartment, Mia40, using different assays (in vivo, in organello, in vitro) tobuild a model that will explain its role in mitochondria. This is an ongoing project andcollaboration with the group of Chris Grant (University of Manchester) withexperiments conducted by Paraskeui Kritsiligkou. In the third chapter, we focused on the protein Dre2, whose function is associatedwith the cytosolic maturation pathway of iron/sulfur cluster proteins (CIA). Thelocalization of this protein in the intermembrane space of mitochondria is supportedby two different scientific groups and was further investigated in this work. Inaddition, we studied its interaction with Mia40, which is the second indication of theconnection of the disulfide exchange pathway with the export pathway for iron/sulfurclusters that is also hosted in the same compartment. The first indication of theassociation of the MIA pathway in the Fe/S cluster biogenesis was the participation ofErv1 in the ISC export. Finally, in this project we set the basis for studying thepotential role of Dre2 as a mediator of the two mitochondrial pathways.

Η βιογένεση των μιτοχονδρίων βασίζεται σε ειδικά μονοπάτια στόχευσης και εισόδουπρωτεϊνών, καθώς οι περισσότερες πρωτεΐνες συντίθενται στο κυτταρόπλασμα καιμετέπειτα εισέρχονται στα διαφορετικά διαμερίσματα. Η ανακάλυψη του οξειδωτικούμονοπατιού αναδίπλωσης πρωτεϊνών στα μιτοχόνδρια, MIA, το 2004 ήταν ένα σημείοκαμπής στην ιστορία των οργανιδίων αυτών. Οι μελέτες που ακολούθησαν εστίασανκυρίως στα μικρά τυπικά υποστρώματα του μονοπατιού και στις αλληλεπιδράσειςτων δύο κεντρικών παραγόντων του, τον οξειδωτικά ελεγχόμενο υποδοχέα Mia40 καιτην σουλφυδριλοξειδάση Erv1. Μεγάλη πρόοδος έχει σημειωθεί τα τελευταία χρόνια,καθώς η λίστα των πρωτεϊνών που αξιοποιούν το μονοπάτι επεκτείνεται διαρκώς μεμεγαλύτερα και πιο πολύπλοκα υποστρώματα, συμπεριλαμβανομένου της ίδιας τηςMia40.Σε αυτή την εργασία, μελετήσαμε τρεις διαφορετικές πρωτεΐνες και την δράση τουςστο διαμεμβρανικό χώρο των μιτοχονδρίων. Στο πρώτο κεφάλαιο, εστιάσαμε στηνοξειδορεδουκτάση Mia40, τα χαρακτηριστικά της ως υπόστρωμα και ορίσαμε μεακρίβεια τα στάδια βιογένεσης της στο σακχαρομύκητα. Τα αποτελέσματα μαςυποστηρίζουν μια κινητικά συντονισμένη ακολουθία γεγονότων, που συνοψίζεται μεείσοδο του πρόδρομου μορίου στα μιτοχόνδρια, εμπέδωση στην εσωτερική μεμβράνημέσω τρανσλοκάσης, αλληλεπίδραση με την ενδογενή ενεργή Mia40 για τηναναδίπλωση του δομικού τμήματος του μορίου και τέλος την οξείδωση τουκαταλυτικού κέντρου της από την Erv1. Οι δύο αυτές κινητικά διακριτέςαλληλεπιδράσεις βασίζονται σε εντελώς διαφορετικούς καθοριστικούς παράγοντες,ενώ η Mia40 παρουσιάζει μια διαφορετική συμπεριφορά σε σύγκριση με άλλαυποστρώματα που χρησιμοποιούν το μιτοχονδριακό οξειδοαναγωγικό μονοπάτι.Στο δεύτερο κεφάλαιο, περιγράφεται η μελέτη της υπεροξειδάσης Gpx3 στοδιαμεμβρανικό χώρο. Η πρωτεΐνη αυτή ήταν γνωστό ότι δρα στο κυτοσόλιο ωςαισθητήρας οξειδωτικού στρες και μεταγωγέας του σήματος έναρξης αντιμετώπισηςτου. Πρόσφατα δημοσιεύθηκε ότι μπορεί να εντοπιστεί επίσης στο διαμεμβρανικόχώρο των μιτοχονδρίων χωρίς όμως να έχουν μελετηθεί ή περιγραφεί οι πιθανέςσυνθήκες υπό τις οποίες κατευθύνεται εκεί. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότιτα μιτοχόνδρια στεγάζουν ένα πιθανό μονοπάτι οξειδοαναγωγικής ρύθμισης, μεβασικό παράγοντα της Gpx3. Στα πλαίσια της μελέτης, αξιολογήσαμε διάφορες αλληλεπιδράσεις εστιάζοντας στονυποδοχέα του διαμερίσματος, Mia40 χρησιμοποιώντας διαφορετικές μεθόδους (invivo, in organello, in vitro) για την οικοδόμηση ενός μοντέλου που θα εξηγεί τονρόλο της στα μιτοχόνδρια. Η εργασία αυτή δεν έχει ολοκληρωθεί και αποτελείσυνεργασία με το εργαστήριο του Chris Grant (University of Manchester) μεπειράματα που έχουν πραγματοποιηθεί από την Παρασκευή Κριτσιλίγκου.Στο τρίτο κεφάλαιο, εστιάσαμε στην πρωτεΐνη Dre2, της οποίας η δράση στοκυτοσόλιο σχετίζεται με την ωρίμανση συμπλόκων σιδήρου/θείου. Η τοποθέτησή τηςπρωτεΐνης αυτής στο διαμεμβρανικό χώρο των μιτοχονδρίων υποστηρίζεται από δύοδιαφορετικές ερευνητικές ομάδες και ερευνήθηκε περαιτέρω σε αυτή την εργασία.Επιπλέον, εξετάστηκε η αλληλεπίδραση της με την Mia40, που αποτελεί την δεύτερηένδειξη σύνδεσης του μονοπατιού ανταλλαγής δισουλφιδίων με το μονοπάτι εξόδουσυμπλόκων σιδήρου/θείου που φιλοξενείται στο ίδιο διαμέρισμα. Η πρώτη ένδειξητης συμμετοχής του MIA μονοπατιού στην ωρίμανση των συμπλόκων Fe/Sαποτέλεσε o συσχετισμός της Erv1 με το μονοπάτι εξόδου. Τέλος, σε αυτή τηνεργασία θέτουμε τις αρχικές βάσεις για την μελέτη του πιθανού ρόλου της Dre2 ωςμεσολαβητή των δύο μονοπατιών.