Ιστολογική και ανοσοϊστοχημική μελέτη του οδοντικού πολφού σε διαβητικούς επίμυες

Abstract

Introduction: Diabetes mellitus is one of the most common endocrine disorders that affects almost 6% of the worldwide population. Its prevalence is increasing. It affects many organs and it can gradually lead to various complications among which microangiopathy is one of the most important, leading to serious dysfunction. Diabetes mellitus effects on the dental pulp have been studied in a limited number of in vivo studies. None of them investigated alterations caused by diabetes in the dental pulp vasculature. In this thesis the alterations of collagen IV expression on the basement membrane of the dental pulp vasculature have been studied. In addition, a complete method for quantitative analysis of digital images from immunohistochemically stained tissues utilizing Fiji image analysis software was described. Materials and methods One group of healthy (Control, n=8) and diabetic (Diabetic, n=8) Wistar rats (age: 10 weeks) were utilized in this research. In the Diabetic group diabetes was induced by intravenous injection of streptozotocin (60 mg/Kg body weight). The study lasted 30 days during which body weight, water and food consumption and fasting blood glucose levels were recorded from all animals on a daily basis. In the Diabetic group a daily subcutaneous insulin injection of 2 IU was performed. On the 30th day, after the daily recording procedure, all animals were euthanized under ether anesthesia and dental pulp from the upper right incisor and the right eye were collected from all groups. The tissues were formalin fixed and embedded in paraffin. Then they were cut in 5 μm sections. All sections were immunohistochemically stained with rabbit polyclonal antibody against collagen IV, utilizing the avidin-biotin complex indirect method. The tissues were digitized with a digital camera mounted on a microscope apparatus. Digital noise was removed, contrast was enhanced and immunostained areas were clarified. In the optimized images quantitative image analysis of vascular collagen IV expression was performed (Fiji software). Two way Student t-test was performed on the data from the quantification procedure with R project for statistical computing. Results Increased food and water consumption was observed during the larger part of study period. In the stained sections with collagen IV antibody intense brown staining on the vascular basement membrane was observed in all tissues. There was not a statistically significant alteration in collagen IV expression between the Control and Diabetic group on the dental pulp tissues (t=1.5454, df=14, p=0.1446, Control: mean±SE=1.8209±0.3896%, Diabetic: mean±SE=1.0188±0.343%). No statistically significant difference in collagen IV expression between the Control and Diabetic group was evident on the episcleral connective tissues (t=1.4002, df=14, p-value=0.1832, Control: mean±SE=0.7253±0.1166%, Diabetic: mean±SE=0.53±0.0752%). Conclusions: We conclude that diabetes mellitus does not produce significant difference of the expression of collagen IV on the basement membrane of dental pulp and episcleral tissue vasculature 30 days after diabetes verification on Wistar rats. The method described in this research work utilizing image analysis techniques on immunohistochemically stained tissues may be used for the quantification of basement membrane collagen IV expression on the dental pulp and episcleral tissue vasculature.

Εισαγωγή: Ο σακχαρώδης διαβήτης είναι μια από τις πιο συνήθεις ενδοκρινικές διαταραχές που επηρεάζει σχεδόν το 6% του πληθυσμού παγκοσμίως. O επιπολασμός του παρουσιάζει αυξητική τάση. Επηρεάζει πολλά διαφορετικά συστήματα οργάνων και με την πάροδο του χρόνου μπορεί να οδηγήσει στην εμφάνιση σοβαρών επιπλοκών. Μια από αυτές είναι η μικροαγγειοπάθεια, η οποία επηρεάζει μεγάλο αριθμό οργάνων προκαλώντας σοβαρές δυσλειτουργίες σε αυτά. Οι επιδράσεις του σακχαρώδους διαβήτη στον οδοντικό πολφό έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα σε πολύ μικρό αριθμό in vivo μελετών. Καμία όμως από αυτές τις μελέτες δεν προσέγγισε τις μεταβολές που μπορεί να προκαλέσει ο σακχαρώδης διαβήτης στα αγγεία του πολφού. Στη διατριβή αυτή μελετήθηκαν οι μεταβολές που προκαλούνται στην έκφραση του κολλαγόνου IV της βασικής μεμβράνης των αγγείων του οδοντικού πολφού. Επίσης περιγράφηκε μια ολοκληρωμένη μέθοδος για ποσοτική ανάλυση ψηφιοποιημένων εικόνων ανοσοϊστοχημικά χρωσμένων ιστών χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης εικόνας Fiji. Υλικά και μεθοδολογία: Μια ομάδα υγιών (Ελέγχου, n=8) και διαβητικών (Διαβητική, n=8) επιμύων Wistar (ηλικίας 10 εβδομάδων) συμμετείχαν σε αυτή τη διατριβή. Στη Διαβητική ομάδα η πρόκληση διαβήτη πραγματοποιήθηκε με ενδοφλέβια χορήγηση στρεπτοζοτοκίνης (60 mg/Kg βάρους). Η μελέτη διήρκεσε 30 ημέρες στις οποίες γινόταν καθημερινή καταγραφή του σωματικού βάρους, κατανάλωσης νερού και τροφής και μέτρηση τιμών σακχάρου νηστείας σε όλα τα πειραματόζωα. Στη Διαβητική ομάδα εφαρμοζόταν καθημερινά υποδόρια έγχυση 2 IU ινσουλίνης για αποφυγή κετοξέωσης. Την 30η ημέρα μετά την καταγραφή όλων των καθημερινών μετρήσεων πραγματοποιήθηκε ευθανασία με αιθέρα και συλλέχθηκε οδοντικός πολφός του άνω δεξιού κοπτήρα και ο δεξιός οφθαλμός από όλες τις ομάδες. Οι ιστοί αρχικά μονιμοποιήθηκαν σε φορμόλη και ενσωματώθηκαν σε παραφίνη. Στη συνέχεια έγιναν τομές πάχους 5 μm. Ακολούθησε ανοσοϊστοχημική χρώση των ιστών με πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι του κολλαγόνου IV με την έμμεση μέθοδο του συμπλέγματος αβιδίνης-βιοτίνης. Οι ιστοί ψηφιοποιήθηκαν με τη βοήθεια ψηφιακής κάμερας τοποθετημένης σε μικροσκόπιο. Ακολούθως έγινε απομάκρυνση του ψηφιακού θορύβου από τις εικόνες, βελτίωση της αντίθεσης και αποσαφήνιση των χρωσμένων περιοχών. Στις βελτιστοποιημένες εικόνες έγινε ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του αγγειακού κολλαγόνου IV (λογισμικό Fiji). Στα δεδομένα από την ποσοτική ανάλυση των εικόνων εφαρμόστηκε Student t-test δύο κατευθύνσεων με τη βοήθεια του ειδικού λογισμικού στατιστικών υπολογισμών R. Αποτελέσματα: Παρατηρήθηκε αυξημένη κατανάλωση τροφής και νερού στη διαβητική ομάδα καθ' όλη σχεδόν τη διάρκεια της μελέτης. Στις χρωσμένες τομές με το αντίσωμα έναντι του κολλαγόνου IV παρατηρήθηκε έντονη ειδική καφέ χρώση στη βασική μεμβράνη των αγγείων και στους δύο ιστούς. Δεν υπήρξε στατιστικώς σημαντική μεταβολή στην έκφραση του κολλαγόνου IV μεταξύ της ομάδας Ελέγχου και της Διαβητικής ομάδας στον οδοντικό πολφό (t=1.5454, df=14, p-value=0.1446, Ελέγχου: mean±SE=1.8209±0.3896%, Διαβητική: mean±SE=1.0188±0.343%). Δεν υπήρξε στατιστικώς σημαντική διαφορά στην έκφραση του κολλαγόνου IV μεταξύ της ομάδας Ελέγχου και της Διαβητικής ομάδας στον επισκλήριο συνδετικό ιστό (t=1.4002, df=14, p-value=0.1832, Ελέγχου: mean±SE=0.7253±0.1166%, Διαβητική: mean±SE=0.53±0.0752%). Συμπεράσματα: Συμπεραίνουμε ότι ο σακχαρώδης διαβήτης δεν προκαλεί σημαντική μεταβολή της έκφρασης του κολλαγόνου IV της βασικής μεμβράνης των αγγείων του οδοντικού πολφού και του επισκλήριου συνδετικού ιστού 30 ημέρες από την εγκατάσταση διαβήτη σε επίμυες Wistar. Με τη μέθοδο που περιγράφηκε στη διατριβή αυτή, με τη χρήση της ειδικής ανοσοϊστοχημικής χρώσης σε συνδυασμό με την ανάλυση εικόνας είναι δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός της έκφρασης του κολλαγόνου IV της βασικής μεμβράνης των αγγείων του οδοντικού πολφού και του επισκλήριου συνδετικού ιστού του οφθαλμού.