Η συμβολή των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, της απόπτωσης και των διαβιβαστών μηνύματος στην εκτίμηση της έκβασης παιδιατρικών εμβρυονικών νεοπλασμάτων του κεντρικού νευρικού συστήματος

Abstract

BackgroundMedulloblastomas (MBs), atypical teratoid/rhabdoid tumors (AT/RTs) and central nervous system primitive neuroectodermal tumors (PNETs) are aggressive embryonal brain neoplasms in children with overlapping histological features but with different pathogenetic pathways.Abnormalities of the cell cycle, apoptosis and signal transduction are molecular features of many brain tumors and are currently under evaluation for potential therapeutic intervention.Despite previous investigations, the role of p-53 tumor suppressor oncoprotein, cyclin Α, cyclin Β1, cyclin D3 and cyclin Ε, p27/kip-1 cyclin/CDK inhibitor, bcl-2 anti-apoptotic protein, epidermal growth factor receptor (EGFR), c-erbB2/HER-2 and c-kit in the pathogenesis of embryonal brain neoplasms has not been fully elucidated. The aim of this study was to investigate the expression of these regulators in pediatric embryonal brain tumors in correlation with histology, expression of the Ki-67/ MIB-1 proliferative index and prognosis.MethodWe evaluated 53 children with embryonic tumors that were diagnosed in the Hematology-Oncology Unit of Athens University, “Aghia Sofia” Children’s Hospital between January 1998 and January 2007, 30 males, 23 females, mean age 6,89 years, range 1 month to 15 years. Forty-two patients had a cerebellar MB. Histologically, 36 cases were classical undifferentiated MBs, 6 were desmoplastic MBs and 1 large cell/anaplastic MB. Nine patients had an AT/RT and 2 patients had a supratentorial PNET. The Bond Polymer Refine kit (Bond Vision Biosystems) on an automated staining system (Bond Max Vision Biosystems) was performed on paraffin sections for the detection of Ki-67/MIB-1, p53 (clone DO-7), cyclin A (clone 6E6), cyclin B1 (clone 7A9), cyclin D3 (clone DCS22), cyclin E (clone 13A), p27/kip-1 (clone B4), bcl-2 (clone 100D), EGFR (clone EGFR25), c-erbB2/HER-2 (clone CB11) and c-kit (clone T595). The appropriate negative and positive controls were used. Detection of Ki-67/MIB-1 and p-27/kip-1 in >50%, p53 protein, Cyclin B1, EGFR and c-kit in >15%, Cyclin A in >40%, Cyclin D3 in >10%, Cyclin E and bcl-2 in>30% and c-erb-B2 /HER2 in >20% of the Progression-free survival was defined as the time between initial surgery and demonstration of tumor progression on follow up imaging or death. Overall survival was defined as the time from surgery to death, or as the time to the last follow-up of the surviving patients. Survival curves were calculated and compared using the Kaplan-Meier method and the log-rank test. Multivariate analysis was performed using the forward stepwise Cox proportional hazard regression model. The following variables were entered: gender, age at diagnosis, histological subtype, and detection of Ki-67 >25%, p27/kip-1, p-53 and bcl-2 >10% of the neoplastic cells, membranous/nuclear detection of cyclin A and membranous/paranuclear of cyclin B1 >5% of the neoplastic cells, nuclear detection of cyclins D3 and E>5%, membranous/cytoplasmic detection of c-erbB2/HER-2 and c-kit in>10, cyclin Ε in >5%, and EGFR in >15%. A 2-sided p value <0.05 was considered statistically significant. We analyzed only the MBs because the number of AT/RTs and PNETs was limited.Three patients were lost to follow-up. After a mean follow up period of 4.4 years(range 6 months to 9.5 years) 30 patients were alive.ResultsHigh expression of Ki-67 (>25%) was observed in thirty-eight MBs being particularly increased (>50% of the nuclei) in 12 cases. All cases of AT/RTs expressed high Ki-67 (>25%), being particularly increased (>50%) in 4/9 cases. All PNETs showed increased Ki-67 (100%). All AT/RTs had increased p-53 (>15%). Two of them expressed p-53 above 50% of the nuclei. 1/2 PNETs expressed high p-53 (>50%).p53 protein was detected in 28/36 MBs showing a high expression (>15% of the nuclei) in 19 cases.Bcl-2 was observed in 11 MBs, in 7/9 cases of AT/RTs and in all PNETs. Cyclin Α was detected in 38 cases of MBs showing a high expression (>40%) in 11 cases. 6/9 AT/RTs expressed cyclin A showing a high expression in 2 cases. Cyclin A was detected in 1/2 PNETs. Cyclin Β1 was observed in 17/42 MBs showing a high expression (>15% of the nuclei) in 9 cases. It was expressed in 5/9 cases of AT/RTs. No expression of cyclin B was observed in any cases of PNETs. Cyclin D3 was releaved in 12/42 MBs showing a high expression (>10% of the nuclei) in 8 cases, while cyclin Ε was detected in 26/42 MBs showing a high expression (>30% of the nuclei) in 6 cases. Cyclin D3 was observed in 2/9 AT/RTs in hogh expression and in 1/2 cases of PNETs. Cyclin E was detected in all AT/RTs but not in any of the PNETs. p27/kip-1 was detected in all 42 MBs with a high expression (>50%) in 37 cases and in all cases of AT/RTs and PNETs. EGFR and c-kit were detected in 9 and 18MBs showing a high expression(>15%) in 8 and 15 cases respectively. EGFR was observed in 5/9 AT/RTs all in high exression while c-kit was expressed in 6/9 cases. EGFR was not expressed in any PNET while c-kit was expressed in 1/2. c-erbB2/HER-2 was observed in 32/42 MBs showing a high expression (>20%) in 23cases. cerbB2 was expressed in 8/9 AT/RTs and in 1/2 PNETs.ConclusionsOn the whole, from the present study the following conclusions are drawn:1) On multivariate analysis, only Ki-67 index was identified as a factor with independent prognostic power.2) In MB patients, Ki-67 index >50% was associated with worse survival.3) p27 was paradoxically expressed in the majority of our cases so it cannot be considered as a reliable index.4) High bcl-2 expression was associated with poorer prognosis.5) Low p53 expression was correlated with better prognosis.6) Cyclin D3 expression did not revealed any association with prognosis7) Cyclin A index >40% was associated with significantly poorer survival. To the best of our knowledge no other study has evaluated the role of cyclin A in patients with MB.8) Cyclin B1 expression was detected in a considerable number of cases, and there was a trend towards poorer survival for patients with cyclin B1 index more than 15%.10) EGFR, HER2 and c-kit expression is variable in pediatric brain tumors. Their expression in a considerable number of MBand ART suggests that it may be implicated in their pathogenesis representing a potential target for novel therapies.Study of the above indices at diagnosis could alter or intensify treatment methods, so as to improve disease outcome. There is obviously a need for future studies with larger number of patients to confirm our preliminary observations.

ΕισαγωγήΤα μυελοβλαστώματα (ΜΒ), οι άτυποι ραβδοειδείς/τερατοειδείς όγκοι (ΑΡΤ) και οι υπερσκηνιδιακοί αρχέγονοι νευροεκτοδερμικοί όγκοι (PNET) αποτελούν επιθετικά εμβρυονικά νεοπλάσματα του ΚΝΣ στα παιδιά και εμφανίζουν συχνά αλληλοεπικαλυπτόμενα κλινικά και ιστολογικά χαρακτηριστικά, αλλά προέρχονται από διαφορετικούς παθογενετικούς μηχανισμούς. Ο ρόλος των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου: του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p-53, των κυκλινών Α, Β1, D3 και Ε, του αναστολέα κυκλινών/κυκλινο-εξαρτωμένων κινασών p27/kip-1 και του ρυθμιστού της απόπτωσης bcl-2, με παράλληλη διερεύνηση της έκφρασης των διαβιβαστών διακυτταρικού μηνύματος: c-kit, c-erb-b2 και EGFR στην παθογένεια ΜΒ, ΑΡΤ και ΚΝΣ PNET δεν έχουν πλήρως διευκρινισθεί.Η έκφραση των παραπάνω ρυθμιστών και διαβιβαστών μηνύματος θα μελετηθεί σε συσχέτιση με τον ιστολογικό τύπο και τα χαρακτηριστικά του νεοπλάσματος, την πολλαπλασιαστική δραστηριότητα των νεοπλασματικών κυττάρων, εκτιμώμενη με την ανίχνευση του δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού Ki-67/MIB-1 και τα κλινικά χαρακτηριστικά και την πρόγνωση των ασθενώνΥλικά και μέθοδοςΤο υλικό της ερευνητικής μας μελέτης απετέλεσαν 53 εμβρυονικοί όγκοι του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος, από τους οποίους οι 42 αφορούν Μυελοβλαστώματα, οι 9 Άτυπους Ραβδοειδείς/Τερατοειδείς Όγκους και οι 2 Υπερσκηνίδιους Αρχέγονους Νευροεκτοδερμικούς Όγκους σε παιδιά, από τη γέννηση μέχρι την ηλικία των 15 ετών.Τα εμβρυονικά αυτά νεοπλάσματα προήλθαν από τους ασθενείς της Μονάδας Αιματολογίας-Ογκολογίας της Α΄ Παιδιατρικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών και από το Παθολογοανατομικό Εργαστήριο του Νοσοκομείου Παίδων «Η Αγία Σοφία», κατά το χρονικό διάστημα 1998-2007.Η ανοσοϊστοχημική μέθοδος βραχείας αλυσίδας πολυμερούς εφαρμόσθηκε σε τομές παραφίνης ιστών πάχους 4μm, οι οποίες είχαν μονιμοποιηθεί σε φορμόλη, με τη χρήση του Bond Polymer Refine kit (Bond Vision Biosystems) σε αυτοματοποιημένο πρόγραμμα (BondMax Vision Biosystems).Όλες οι σειρές συμπεριλάμβαναν και τους κατάλληλους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες.ΑποτελέσματαΟ δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού Ki-67/MIB-1 ανιχνεύθηκε σε όλες τις περιπτώσεις των ΜΒ με έκφραση του >25% των πυρήνων των νεοπλασματικών κυττάρων σε ποσοστό 90,4%. Ο δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού Ki-67 ανιχνεύθηκε σε όλους τους άτυπους ραβδοειδείς/τερατοειδείς όγκους και σε όλους τους PNET με υψηλή έκφραση.Η p-27 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε, επίσης, σε όλες τις περιπτώσεις των μυελοβλαστωμάτων, των ΑΡΤ και των PNET. Υψηλή έκφραση αυτής (>50% των πυρήνων) παρατηρήθηκε σε 37 μυελοβλαστώματα, σε 7 ΑΡΤ και σε όλους τους PNET.Η p-53 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε 28 μυελοβλαστώματα, (66,6%), σε όλους τους ΑΡΤ και στο 50% των PNET. Υψηλή πυρηνική έκφραση (>15%) ανιχνεύθηκε σε 19 περιπτώσεις ΜΒ, σε 2 περιπτώσεις ΑΡΤ και στη μία περίπτωση του PNET.Η bcl-2 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε 11 μυελοβλαστώματα, (26,1%), με υψηλή έκφραση (>30%) σε 6 (54,5%), στους 7 από τους 9 ΑΡΤ, στους 5 από τους οποίους με υψηλή έκφραση και σε όλους τους PNET.Η κυκλίνη Α ανιχνεύθηκε σε 38 μυελοβλαστώματα (90,4%), με υψηλή έκφραση (>40%) σε 11 μυελοβλαστώματα (26,1%). 6 ΑΡΤ ανέδειξαν θετικότητα στην κυκλίνη Α, 2 εκ των οποίων με υψηλή έκφραση, ενώ όλοι οι PNET βρέθηκαν θετικοί.Η κυκλίνη Β1 ανιχνεύθηκε σε 17 μυελοβλαστώματα (ποσοστό 40,4%), με υψηλή πυρηνική έκφραση κυκλίνης Β1 (>15%) σε 9 (52,9%). Η κυκλίνη Β1 ανιχνεύθηκε θετική σε 5 ΑΡΤ (55,5%) με υψηλή έκφραση σε 3 από αυτούς. Η κυκλίνη Β1 δεν εκφράστηκε σε κανένα PNET.Η κυκλίνη D3 και η κυκλίνη E ανιχνεύθηκαν σε 12 (28,5%) και 26 (61,9%) μυελοβλαστώματα και σε 2 (22,2) και 9 (100%) ΑΡΤ αντίστοιχα. Η κυκλίνη D3 ανιχνεύθηκε σε 1 PNET (50%) ενώ η κυκλίνη E δεν εκφράστηκε καθόλου.Ο διαβιβαστής διακυτταρικών μηνυμάτων EGFR ανιχνεύθηκε σε 9 μυελοβλαστώματα (21,4%) με υψηλή έκφραση (>15%) σε 8 (88,8%). Ο EGFR ανιχνεύθηκε σε 5 άτυπους ραβδοειδείς/τερατοειδείς όγκους, (55,5%), με υψηλή έκφραση και στους 5. Ο EGFR δεν εκφράστηκε σε κανένα PNET.Ο c-erbB-2/HER2 ανιχνεύθηκε σε 32 μυελοβλαστώματα (76%) με υψηλή έκφραση στα 23(71,8%), σε 8 ΑΡΤ (88,8%) σε 6 εκ των οποίων με υψηλή έκφραση (75%) και σε ένα εκ των 2 PNET με υψηλή έκφραση.Ο διαβιβαστής διακυτταρικών μηνυμάτων c-kit ανιχνεύθηκε με μεμβρανική/κυτταροπλασματική έκφραση σε 18 μυελοβλαστώματα (ποσοστό 42,8%) με υψηλή έκφραση (>15%) σε 15 από αυτά (ποσοστό 83,3%). ΣυμπεράσματαΗ στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων μας έδειξε ότι ο Ki-67 αποτελεί το μοναδικό ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη και ότι όλοι οι εμβρυονικοί όγκοι παρουσιάζουν αυξημένο δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού Ki-67, ο οποίος όταν είναι λίαν υψηλός σχετίζεται με την πρόγνωση.Η υψηλή έκφραση της p-27 πρωτεΐνης είναι παράδοξη, ούτως ώστε η ανίχνευσή της να μη μπορεί να μην αποτελεί αξιόπιστο δείκτη.Όσον αφορά την ανίχνευση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης bcl-2, φαίνεται από τη μελέτη μας να σχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών.Αναφορικά με την έκφραση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p-53 επιβεβαιώνεται συσχέτιση με την πρόγνωση.Αναφορικά με την ανίχνευση της κυκλίνης D3 δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης αυτής και του ιστολογικού τύπου του εμβρυονικού νεοπλάσματος.Η παράλληλη αύξηση Ki-67 και p27 σε συνδυασμό με την ανίχνευση της κυκλίνης Ε στην πλειοψηφία των ΜΒ και στους ΑΡΤ συνηγορεί για διαταραχές της G1/S μετάπτωσης του κυτταρικού κύκλου πιθανότατα σχετιζόμενες με πειραματικά αποδεδειγμένες γενετικές ανωμαλίες.Όσον αφορά την ανίχνευση των κυκλινών Α και Β1 αυτή συνηγορεί υπέρ διαταραχών του κυτταρικού κύκλου στη φάση της μίτωσης.Τέλος, η υπερέκφραση των διαβιβαστών μηνύματος EGFR, c-erbB-2/HER2 και c-kit σε ένα μεγάλο ποσοστό μυελοβλαστωμάτων φαίνεται ότι έχει σχέση με επιθετικότερη βιολογική συμπεριφορά, και θέτει την υπόνοια ότι εμπλέκονται στην παθογένεια τους και πιθανόν αντιπροσωπεύουν δυνητικό στόχο για νέες θεραπευτικές μεθόδους.