Προεμφυτευτική γενετική διάγνωση σε φυλοσύνδετα νοσήματα και τρισωμίες

Abstract

Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) represents a diagnostic procedure which avoids termination of an affected pregnancy by transferring genetically healthy IVF embryos. The majority of clinics performing PGD use cleavage stage embryo biopsy on day 3, to remove 1-2 blastomeres. Single cell diagnosis is mostly performed using FISH for the analysis of chromosomes and PCR for the analysis of genes in cases of monogenic diseases. Difficulties of a single-cell PCR based diagnosis include contamination, PCR failure and the effect of Allele Drop Out (ADO). ADO is where there is amplification failure of one of the two heterozygous alleles whilst the other allele successfully amplifies and may result in misdiagnosis. The first step towards the development of this study was to practice in single-cell molecular diagnosis. This involved the design and optimization of a PCR- based protocol applicable to PGD diagnosis for Spinal Muscular Atrophy-SMA, a severe neurodegenerative autosomal recessive disorder. The majority of SMA patients shows homozygous deletion of the telomeric SMN gene (Spinal Motor Neuron Gene-SMN1) on chromosome 5q. The conditions for a 3plex PCR, allowing the specific detection of the SMN1 gene and two linked polymorphic markers, were established. The protocol was standardized on 160 single lymphocytes and subsequently applied in a clinical PGD cycle. The primary aim of this study was to design an accurate, robust, rapid protocol allowing simultaneous investigation of both the embryonic gender and the single gene defect, applicable to PGD diagnosis for the wide spectrum of severe X-linked and gender dependant diseases. To preclude the rejection of unaffected male embryos which cannot be differentiated from the affected as when using FISH, we standardized and validated a flexible protocol based on multiplex fluorescent PCR for gender determination in single-cells, which can potentially incorporate any disease-specific locus. The final panel of 9 loci included 4 loci on the Y chromosome, 4 on the X-chromosome and 1 on an autosomal chromosome for additional monitoring of contamination, whilst addressing the inherent problems of single-cell PCR. The 9plex PCR was optimised using 294 single lymphocytes. Proof of principle for the simplicity and flexibility of the basic single-tube multiplex PCR-based protocol was demonstrated by the fact that it was easily modified to detect embryonic gender and a single gene defect both, of a gender dependent disease, Lipoid Congenital Adrenal Hyperplasia (LCAH) and an X-linked disorder, Duchenne Muscular Dystrophy (DMD).

Η προεμφυτευτική γενετική διάγνωση ΠΓΔ (preimplantation genetic diagnosis-PGD) αποτελεί μια νέα μορφή πρόληψης γενετικών νοσημάτων που εφαρμόζεται σήμερα χάρη στην εξέλιξη τριών διαφορετικών τομέων: της εξωσωματικής γονιμοποίησης, της εμβρυολογίας και της γενετικής διάγνωσης. Η ΠΓΔ προσφέρει τη δυνατότητα μοριακής και κυτταρογενετικής εξέτασης εμβρύων που προκύπτουν από τεχνητή γονιμοποίηση έτσι ώστε να ακολουθήσει επιλογή και εμφύτευση του υγιούς εμβρύου στη μήτρα. Η διάγνωση στο επίπεδο του ενός κυττάρου (single cell diagnosis), μετά τη βιοψία εμβρύου, πραγματοποιείται είτε με κυτταρογενετικές είτε με μοριακές τεχνικές. Οι μοριακές τεχνικές αφορούν συνήθως την μελέτη μοριακών αλλοιώσεων μονογονιδιακών νοσημάτων. Στα πλαίσια της εκπαίδευσης στις μοριακές τεχνικές σε προεμφυτευτικό επίπεδο, προτυπώθηκε πρωτόκολλο ΠΓΔ για τη Νωτιαία Μυϊκή Ατροφία (Spinal Muscular Atrophy-SMA), μονογονιδιακό νευρομυϊκό νόσημα το οποίο αποτελεί την πιο συχνή αιτία βρεφικής θνησιμότητας. Η μεθοδολογία, η οποία βασίζεται σε τριπλό PCR για τον πολλαπλασιασμό της υπεύθυνης μοριακής βλάβης και δύο πολυμορφικών δεικτών κοντά σε αυτήν, αξιολογήθηκε μετά την εφαρμογή της σε 160 μεμονωμένα λεμφοκύτταρα και αποδείχθηκε αξιόπιστη ώστε να εφαρμοστεί σε πραγματικό κύκλο Προεμφυτευτικής Γενετικής Διάγνωσης. Στόχος της διατριβής αυτής αποτέλεσε ο σχεδιασμός πρωτοκόλλου για προεμφυτευτική γενετική διάγνωση με επιλογή φύλου σε φυλοσύνδετα νοσήματα. Η επιλογή φύλου του εμβρύου πραγματοποιείται αυστηρά για ιατρικούς λόγους και μόνο στην περίπτωση που στην οικογένεια υπάρχει ιστορικό φυλοσύνδετου νοσήματος. Το πρωτόκολλο περιλαμβάνει την εφαρμογή πολλαπλού PCR με στόχο τον πολλαπλασιασμό 9 διαφορετικών θέσεων εκ των οποίων 4 βρίσκονται στο χρωμόσωμα Y, 4 στο χρωμόσωμα Χ και 1 θέση στο χρωμόσωμα 13. Οι 3 από τις 9 θέσεις αποτελούν πολυμορφικούς δείκτες οι οποίοι εκτός από τον έλεγχο πιθανής επιμόλυνσης, αποτελούν εσωτερικούς δείκτες για τη σωστή κληρονόμηση των αλληλομόρφων. Η μεθοδολογία αυτή αξιολογήθηκε μετά την εφαρμογή της σε 294 μεμονωμένα λεμφοκύτταρα και αποδείχθηκε αξιόπιστη ώστε να εφαρμοστεί σε πραγματικό κύκλο Προεμφυτευτικής Γενετικής Διάγνωσης. Βασικό πλεονέκτημα του πρωτοκόλλου αυτού αποτελεί η μεγάλη ευελιξία του: μπορεί να πραγματοποιηθεί η αφαίρεση μίας θέσης από τις 9 που πολλαπλασιάζονται ώστε να προστεθεί κάποια άλλη, δυνατότητα που βρίσκει εφαρμογή στον ταυτόχρονο προσδιορισμό φύλου και ανίχνευσης μοριακής βλάβης φυλοσύνδετου ή φυλοεπηρεαζόμενου μονογονιδιακού νοσήματος με γνωστή μοριακή βλάβη. Η ευελιξία αυτή του πρωτοκόλλου αποδεικνύεται με την εφαρμογή του σε πραγματικό κύκλο ΠΓΔ για το φυλοεπηρεαζόμενο νόσημα της Λιποειδoύς Συγγενής Υπερπλασίας των επινεφριδίων (Lipoid Congenital Adrenal Hyperplasia - LCAH) το οποίο εμφανίζει βαρύτερη κλινική εικόνα στα άρρενα από ότι στα θήλεα άτομα. Το πρωτόκολλο ΠΓΔ για φυλοσύνδετα και φυλοεπηρεαζόμενα νοσήματα τροποποιήθηκε και αξιολογήθηκε ώστε να περιλαμβάνει τη μοριακή βλάβη που φέρουν οι υποψήφιοι γονείς και αποτέλεσε την πρώτη εφαρμογή ΠΓΔ για το νόσημα αυτό. Επιτεύχθηκε μονήρης κύηση η οποία ελέγχθηκε με προγεννητικό έλεγχο και ολοκληρώθηκε χωρίς επιπλοκές οδηγώντας στη γέννηση ενός υγιούς κοριτσιού, η οποία αποτελεί την πρώτη ολοκληρωμένη κύηση από ασθενή με LCAH που έχει αναφερθεί μέχρι σήμερα.