Μελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν τη βιωσιμότητα και τη φυσιολογική ανάπτυξη των εμβρύων μετά από κρυοσυντήρηση με την τεχνική της ταχείας ψύξης (vitrification)

Abstract

Introduction: The aim of this study was the combination of different factors in order to improve the efficiency and ergonomics of ultra-rapid and aseptic vitrification, and examine the impact of vitrification on the cytoskeletal structure of blastocysts.Materials and methods: Concerning ultra-rapid vitrification process, initially was analyzed the impact of the concentration of cryoprotectants’ (EG & DMSO) in the equilibrating (NVS) (7.5% / 7.5% vs. 10% / 10%) and vitrification (VS) (15% / 15% vs. 20% / 20%) solutions, the duration of exposure of embryos to the NVS solution (variable 2 ', 3', 4 'vs. stable 4'), the temperature of the NVS and VS solutions (RT vs. 37oC), the duration of culture after warming (3h vs. 18h) and the application of assisted hatching. These parameters were tested in assisted reproduction cycles with supernumerary embryos that were selected for vitrification and subsequently warmed and transferred in a future cycle. The resulting findings were integrated in modified ultra-rapid vitrification protocol, which effectiveness was subsequently tested in comparison with corresponding fresh embryo transfers. Furthermore, in order to modify the above ultra- rapid vitrification protocol and adjust it to the lower cooling rate conditions reached during aseptic vitrification, a series of experiments were performed in order to increase the intracellular concentration of cryoprotectants while maintaining cytotoxicity levels low. Specifically, we studied the direct increase of the exposure time to the NVS solution (4' vs. 8') and the indirect increase using dilutions of 25% and 50% of the original 100% NVS solution (5'-25% & 10 ' -50% & 4'-100% vs. 5'-50% & 4'-100% vs. 10'-50% & 4 '100%). Then, the effectiveness of the modified aseptic vitrification protocol was compared with the ultra-rapid vitrification protocol. Finally, the impact of aseptic vitrification on cytoskeletal and mitotic spindles of trophectoderm cells was assessed.Results: The main outcome parameters studied were the survival rate, the implantation rate and the clinical pregnancy rate. Increasing the concentration of cryoprotectants in equilibrating (NVS) (7.5% / 7.5% vs. 10% / 10%) and vitrification (VS) (15% / 15% vs. 20% / 20%) solutions did not affect the outcome parameters and resulted in statistically non significant differences. Indeed, there was a marginal increase in the survival rate (80.86% vs. 84.42%) and the clinical pregnancy rate (34.7% vs. 38.8%). Similarly, the study of the exposure time of embryos to the solution NVS (variable 2 ', 3', 4 'vs. Stable 4') resulted in statistically non significant differences for the three outcome parameters, respectively (85% vs. 81%, 26.1 vs. 27.2%, 36.2% vs. 39.1%). The study of cryoprotectants’ temperature (37oC vs. RT) showed no statistically significant differences (83.8% vs.82.9%, 26.9% vs. 27.7%, 43.4% vs. 52.1%), although an improving trend in favor of the lower temperature was recorded in the clinical pregnancy rate. Furthermore, the increase of the culture duration after warming, resulted in non-significant reduction of survival rate (85.32% vs. 80.22%) and marginally non-statistically significant increase in the rate of clinical pregnancy and implantation (27.27% vs. 37.2% ; p = 0.07, 43.1% vs. 57.1%; p = 0.11), respectively. Concerning the study on the impact of assisted hatching, there were no statistically significant differences in the main outcome parameters (82.8% vs. 77.8%, 33.3% vs.34.7%, 58.1% vs. 54.3%). Finally, the comparison of fresh embryo transfers (donor-recipient synchronization) to vitrified – warmed embryo transfers (no donor-recipient synchronization) resulted in a significant increase in the rate of clinical pregnancy (54.9% vs. 67.2 %; p = 0.02) in the second group.Furthermore, the study on the increase of the exposure time in the NVS solution from 4 'to 8', resulted in survival rates of 48% and 65% respectively, while the indirect increase using gradual exposure to different cryoprotectants solutions of lower concentration (5'-25% & 10'-50% & 4'-100% vs. 5'-50% & 4'-100% vs. 10'-50% & 4 '100%) led in survival rates of 80%, 84% and 80%, for the three combinations, respectively. Finally, the comparison of ultra-rapid and aseptic vitrification led to similar results, with no statistically significant differences (84.1% vs. 82.1%, 25.6% vs. 24.5%, 45.9% vs. 42.4%) for the main outcome parameters, respectively.The study of aseptic vitrification in relation to the cytoskeletal structure and mitotic spindles of trophectoderm cells, revealed that the vitrified blastocysts exhibited higher levels of cytoskeletal abnormalities, including spindle malformations and arrangement of chromosomes (p <0.05).Discussion: In the present study the advantages of the main ultra-rapid vitrification strategies were tested and combined, leading to the formation of a modified vitrification protocol without subjective options (e.g. complete equilibration) and auxiliary techniques (e.g. assisted hatching, artificial shrinking), maintaining the process simple, short in duration and compatible to embryos (blastocysts) of all developmental stages. Additionally, for the transition to aseptic vitrification, the protocol of ultra-rapid vitrification was adapted successfully at low rate cooling conditions. Considering the normal perinatal outcomes as recorded in this study and in other relevant publications, the application of aseptic vitrification of blastocysts is a safe and effective procedure for the cryopreservation of embryos resulting from IVF cycles.

Εισαγωγή: Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν ο συνδυασμός διαφόρων παραγόντων ώστε να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα αλλά και η εργονομία της υαλοποίησης κλειστού και ανοικτού τύπου, καθώς και να ερευνηθούν τυχών επιπτώσεις της υαλοποίησης στον κυτταροσκελετό βλαστοκύστεων.Υλικό και μέθοδοι: Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης των κρυοπροστατευτικών ουσιών EG και DMSO των διαλυμάτων εξισορρόπησης (NVS) (7.5%/7.5% vs. 10%/10%) και υαλοποίησης (VS) (15%/15% vs. 20%/20%), ο χρόνος έκθεσης των εμβρύων στο διάλυμα NVS (μεταβλητός 2’,3’,4’ vs. σταθερός 4’), η θερμοκρασία διατήρησης των διαλυμάτων NVS και VS (RT vs. 37oC), ο χρόνος καλλιέργειας των εμβρύων μετά την αναθέρμανσή τους και η εφαρμογή της υποβοηθούμενης εκκόλαψης. Οι παράγοντες αυτοί ελέχθησαν σε κύκλους υποβοηθούμενης αναπαραγωγής με υπεράριθμα έμβρυα τα οποία επιλέχθηκαν για υαλοποίηση και στην συνέχεια αναθερμάνθηκαν και μεταφέρθηκαν. Ακολούθως τα συμπεράσματα από τους πρώτους ελέγχους οδήγησαν στην κατάρτιση ενός πρωτοκόλλου υπέρ ταχείας υαλοποίησης του οποίου η αποτελεσματικότητα ελέγχθηκε σε σύγκριση με τη μεταφορά φρέσκων εμβρύων αντίστοιχων κύκλων υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Στη συνέχεια, προκειμένου να τροποποιηθεί το παραπάνω πρωτόκολλο υπέρ ταχείας υαλοποίησης και να προσαρμοστεί στις συνθήκες χαμηλότερου ρυθμού ψύξης που επιτυγχάνεται κατά την άσηπτη υαλοποίηση, πραγματοποιήθηκαν μια σειρά από πειράματα που κύριο στόχο είχαν την αύξηση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης κρυοπροστατευτικών κρατώντας παράλληλα χαμηλά τα επίπεδα κυτταροτοξικότητας. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η άμεση αύξηση του χρόνου έκθεσης στο διάλυμα NVS (4’ vs. 8’) και η έμμεση αύξηση του χρόνου έκθεσης στο διάλυμα NVS χρησιμοποιώντας αραιώσεις 25% και 50% του αρχικού διαλύματος NVS (5’- 25% & 10’-50% & 4’-100% vs. 5’-50% & 4’-100% vs. 10’-50% & 4’ 100%). Τα έμβρυα αυτά είχαν δωρηθεί για ερευνητικούς σκοπούς και μελετήθηκε η επιβίωση και ο βαθμός ανάπτυξής τους μετά από 24 ώρες. Από τα συμπεράσματα των παραπάνω πειραμάτων καταρτίστηκε πρωτόκολλο άσηπτης υαλοποίησης η αποτελεσματικότητα του οποίου ελέγχθηκε σε σχέση με το πρωτόκολλο υπέρ ταχείας υαλοποίησης. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της άσηπτης υαλοποίησης στον κυτταροσκελετό και τις μιτωτικές ατράκτους κυττάρων του τροφεκτοδέρματος υαλοποιημένων βλαστοκύστεων.Αποτελέσματα: Οι κύριες παράμετροι έκβασης που μελετήθηκαν ήταν το ποσοστό επιβίωσης, το ποσοστό εμφύτευσης και το ποσοστό κλινικής κύησης. Η αύξηση της συγκέντρωσης των κρυοπροστατευτικών ουσιών EG και DMSO των διαλυμάτων εξισορρόπησης (NVS) (7.5%/7.5% vs. 10%/10%) και υαλοποίησης (VS) (15%/15% vs. 20%/20%) δεν επηρέασε αρνητικά τις παραμέτρους έκβασης και οδήγησε σε στατιστικά μη σημαντικές διαφορές. Μάλιστα, παρατηρήθηκε οριακή αύξηση του ποσοστού επιβίωσης (80.86% vs. 84.42%) και του ποσοστού κλινικής κύησης (34.7% vs.38.8%). Ομοίως η μελέτη του χρόνου έκθεσης των εμβρύων στο διάλυμα NVS (μεταβλητός 2’,3’,4’ vs. σταθερός 4’) οδήγησε σε στατιστικά μη σημαντικές διαφορές για τις τρεις παραμέτρους έκβασης αντίστοιχα (85% vs. 81%, 26.1 vs. 27.2%, 36.2% vs. 39.1%). Επίσης, η μελέτη μείωσης της θερμοκρασίας (37οC vs. RT) οδήγησε και πάλι σε στατιστικά μη σημαντικές διαφορές (83.8% vs.82.9%, 26.9% vs. 27.7%, 43.4% vs. 52.1%), εμφανίζοντας μάλιστα τάση βελτίωσης του ποσοστού κλινικής κύησης. Επιπλέον, η αύξηση του χρόνου καλλιέργειας μετά την αναθέρμανση, οδήγησε σε στατιστικά μη σημαντική μείωση του ποσοστού εμφύτευσης (85.32% vs. 80.22%) αλλά και σε οριακά στατιστικά μη σημαντική, αύξηση του ποσοστού εμφύτευσης και κλινικής κύησης (27.27% vs. 37.2%; p=0.07, 43.1% vs. 57.1%; p=0.11). Όσων αφορά τη μελέτη επίδρασης της υποβοηθούμενης εκκόλαψης, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στις κύριες παραμέτρους έκβασης (82.8% vs. 77.8%, 33.3% vs.34.7%, 58.1% vs. 54.3%). Τέλος, σε κύκλους υποβοηθούμενης αναπαραγωγής με δωρεά ωαρίων, η σύγκριση εμβρυομεταφορών φρέσκων εμβρύων με συγχρονισμό δότριας-λήπτριας και εμβρύων μετά από υπέρ ταχεία υαλοποίηση και αναθέρμανση, χωρίς συγχρονισμό δότριας-λήπτριας, οδήγησε σε σημαντική αύξηση του ποσοστού κλινικής κύησης (54.9% vs. 67.2%; p=0.02). Η μελέτη άμεσης αύξησης του χρόνου έκθεσης στο διάλυμα NVS από 4’ σε 8’, οδήγησε μετά από καλλιέργεια 18 ωρών σε ποσοστά επιβίωσης 48% και 65%, αντίστοιχα, ενώ η έμμεση αύξηση του χρόνου έκθεσης στο διάλυμα NVS χρησιμοποιώντας αραιώσεις 25% και 50% του αρχικού διαλύματος NVS (5’- 25% & 10’-50% & 4’-100% vs. 5’-50% & 4’-100% vs. 10’-50% & 4’ 100%) οδήγησε σε ποσοστά επιβίωσης 80%, 84% και 80%, για τους τρεις συνδυασμούς σταδιακής έκθεσης στα κρυοπροστατευτικά διαλύματα, αντίστοιχα. Τέλος, η σύγκριση εμβρυομεταφορών μετά από υπέρ ταχεία και άσηπτη υαλοποίηση οδήγησε σε παραπλήσια αποτελέσματα, με στατιστικά μη σημαντικές διαφορές (84.1% vs. 82.1%, 25.6% vs. 24.5%, 45.9% vs. 42.4%) για τις κύριες παραμέτρους έκβασης αντίστοιχα.H επίδραση της άσηπτης υαλοποίησης στον κυτταροσκελετό και τις μιτωτικές ατράκτους κυττάρων του τροφεκτοδέρματος, απεκάλυψε ότι οι υαλοποιημένες βλαστοκύστεις παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα κυτταροσκελετικών ανωμαλιών, συμπεριλαμβανομένων των αλλοιώσεων στη δομή της ατράκτου και στη διάταξη των χρωμοσωμάτων, σε σχέση με τις φρέσκες (p<0.05).Συζήτηση: Στην παρούσα μελέτη θελήσαμε να συνδυάσουμε τα πλεονεκτήματα των κύριων στρατηγικών υπέρ-ταχείας υαλοποίησης με γνώμονα την μείωση των υποκειμενικών επιλογών (π.χ. πλήρης εξισορρόπηση) και των παράλληλων τεχνικών (π.χ. υποβοηθούμενη εκκόλαψη, τεχνητή συρρίκνωση βλαστόκοιλου) ώστε η μεθοδολογία να είναι απλή, σύντομη και συμβατή με έμβρυα (βλαστοκύστεις) όλων των αναπτυξιακών σταδίων. Κατά την μετάβαση στην άσηπτη υαλοποίηση, η διαδικασία υπέρ-ταχείας υαλοποίησης προσαρμόστηκε με επιτυχία σε συνθήκες χαμηλής ταχύτητας ψύξης. Λαμβάνοντας υπόψη τα φυσιολογικά περιγεννητικά αποτελέσματα όπως καταγράφηκαν στην παρούσα μελέτη αλλά και από άλλες βιβλιογραφικές αναφορές, η εφαρμογή της άσηπτης υαλοποίησης βλαστοκύστεων αποτελεί μια ασφαλή και αποτελεσματική διαδικασία για τη κρυοσυντήρηση εμβρύων που προκύπτουν από κύκλους εξωσωματικής γονιμοποίησης.