Πρωτεϊνική μηχανική του ενζύμου μεταφοράση της γλουταθειόνης με στόχο την ανάπτυξη βιοαισθητήρα μέτρησης ξενοβιοτικών ενώσεων

Abstract

Glutathione S-transferases (GSTs, EC 2.5.1.8), are multifunctional enzymes that catalyze the nucleophilic addition of the sulfur atom of glutathione to the electrophilic groups of a large variety of endogenic and xenobiotic (such as drugs, pesticides), thereby increasing their solubility and helping their excretion from the cell. GSTs can be found in mammalians, plants, insects, bacteria and fungi. They have also more functions, like peroxidase, isomerase and dehydroascorbate reductase activity. In addition, GSTs are implicated in the intracellular transport and storage of a broad range of structurally diverse hydrophobic ligands. GSTs structural flexibility allows exhibit different catalytic functions. The purpose of the present thesis, was the evaluation of GSTs enzymes that could be used for the development of simple analytical methods for pesticides determination. This research can be divided in three parts, with the first one (Chapter 3) describes results from human GSTs, while the other two (Chapter 4 and 5) deal with plant GSTs.In the first part human GSTs (hGSTP1*A, hGSTP1*B, hGSTP1*C, hGSTA1-1, hGSTT2-2 and hGSTO1-1), were expressed and purified using affinity chromatography. Then, screening was carried out, for the evaluation of the inhibition potency of these isoenzymes, toward a wide range of insecticides and herbicides. The purpose of this project, was to develop simple assays for the determination of pesticides in water samples, based on GSTs use. The insecticides dieldrin and spiromesifen were identified as potent reversible inhibitors toward hGSTA1-1, with IC50 values equal to 17.9 ±1.7 μM and 12.1 ±3.4 μM, respectively. Based on in silico docking analysis and kinetic inhibition studies it was concluded that dieldrin and spiromesifen bind specifically to the enzyme presumably, at a distinct position that partially overlaps with both the G- and H-site. The ability of dieldrin and spiromesifen to inhibit hGSTA1-1 activity, was exploited for the development of analytical quantification assays for these two pesticides. Linear calibration curves were obtained for dieldrin and spiromesifen, with useful concentration in the range of 0–10 μM. The reproducibility of the assay response, expressed by relative standard deviation, was in the order of 4.1% (N = 28). The method was successfully applied to the determination of these pesticides in real water samples, without sample preparation steps. The enzyme-based assays have potential advantages over bioassays and other analytical methods based on HPLC, in terms of lower cost and technical complexity. Moreover, they provide reasonable sensitivity for certain applications, such as the direct determination of pesticide residues in water samples.Plant GSTs comprise a family of isoenzymes that play essential role in plant defense under biotic and abiotic stress, as well as in pesticide detoxification. Four GST isoenzymes from leaves of P.vulgaris, were isolated. Analysis of the cDNA clones, showed that the deduced amino acid sequences share high homology with GSTs that belong to phi and tau classes. The isoenzymes were expressed in E. coli and their substrate specificity was determined towards 20 different substrates. The results showed that the GSTs from P. vulgaris (PvGSTs), catalyze a broad range of reactions and exhibit quite varied substrate specificity. Structural analysis shows that PvGSTs share the same overall structure like others cytosolic plant GSTs, with differences at their active center and in the C-terminal domain, as well as in the linker of N- and C- terminal domains. The structural heterogeneity within the C-terminal domain seems to be responsible for the substrate variability and specificity across PvGSTs. After treatment of P.vulgaris and G.max under stress conditions, for the GST induction, RNA was isolated for cDNA creation, using degenerated primers and reverse transcription-PCR. Large diversity in GST genes was accomplished employing directed evolution through DNA shuffling. The shuffled library of new GST genes was cloned and expressed in E. coli. Screening of the library led to the isolation of a novel GST enzyme that displays both glutathione transferase and glutathione peroxidase activities. The enzyme was purified by affinity chromatography and characterized by kinetic analysis towards 20 different substrates and 66 different pesticides. The results showed that the organocloride insecticides and strobilurins (fungicides) are strong inhibitors of the enzyme. The specificity of the enzyme towards pesticides was further improved using site-saturation mutagenesis at position Phe117. Seven new mutants were selected and characterized. The mutant Phe117Ile displays 5-fold higher catalytic efficiency and higher sensitivity towards organochloride insecticides. Therefore, the mutant GSTPhe117Ile was used for the research development of an optical biosensor. The enzyme was immobilized in alkosixylane (TEOS/PTMOS) sol-gel system in the presence of the pH indicators bromocresol purple (acidic) and phenol red (basic). The bioactive material exhibits linear regression in the range pH=4-7 at 562 nm and was used for the development of an analytical method for the determination of α-endosulfan. The calibration curve and analytical range for α-endosulfan determination is 0-30 μM.

Οι μεταφοράσες της γλουταθειόνης (glutathione S-transferases, GSTs, EC 2.5.1.8), είναι πολυλειτουργικά ένζυμα, που καταλύουν την πυρηνόφιλη προσβολή της σουλφυδρυλικής ομάδας του τριπεπτιδίου της γλουταθειόνης (GSH) στο ηλεκτρονιόφιλο κέντρο ενδογενών και ξενοβιοτικών ενώσεων (π.χ. φαρμάκων, φυτοπροστατευτικών προϊόντων), σχηματίζοντας υδατοδιαλυτά σύμπλοκα. Τα σύμπλοκα αυτά, απεκκρίνονται εύκολα από το κύτταρο. Οι GSTs απαντούν στα θηλαστικά, στα φυτά, στα έντομα, στους μύκητες και στα βακτήρια. Παρουσιάζουν ακόμα δράση υπεροξειδάσης, ισομεράσης, διϋδροασκορβικής ρεδουκτάσης. Τέλος, λειτουργούν και ως μεταφορείς υδρόφοβων μορίων για τη μεταφορά και αποθήκευση τους, μέσα στο κύτταρο. Η δομική τους ευελιξία είναι αυτή που επιτρέπει και τη διαφοροποίηση της καταλυτικής τους δράσης. Συνολικά ο σκοπός της παρούσας διατριβής, ήταν η εύρεση ενζύμων GSTs που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν, για την ανάπτυξη απλών αναλυτικών μεθόδων με δυνατότητα κατασκευής βιοαισθητήρα, για τον προσδιορισμό φυτοπροστατευτικών προϊόντων σε δείγματα κυρίως περιβαλλοντικά, αλλά και βιολογικά. Η αναγκαιότητα τέτοιου είδους ερευνών είναι αδιαμφισβήτητη, λόγω της αλόγιστης χρήσης φυτοπροστατευτικών προϊόντων, της υπολειμματικότητας που εμφανίζουν και της τοξικότητας τους στα οικοσυστήματα. Η έρευνα αυτή χωρίστηκε σε τρείς επιμέρους, όπου στη πρώτη (Κεφάλαιο 3), μελετήθηκαν GSTs από τον άνθρωπο, ενώ οι άλλες δύο (Κεφάλαιο 4 και 5) αφορούσαν σε φυτικές GSTs.Στην πρώτη μελέτη, μελετήθηκαν ισοένζυμα από τον άνθρωπο, ως προς τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Αφού λοιπόν πρώτα εκφράστηκαν τα ισοένζυμα hGSTP1*A, hGSTP1*B, hGSTP1*C, hGSTA1-1, hGSTT2-2 και hGSTO1-1, καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας, ακολούθησε σάρωση ως προς μεγάλη ποικιλία ζιζανιοκτόνων και εντομοκτόνων. Από τις μετρήσεις προέκυψε ότι, το hGSTA1-1 φαίνεται να αναστέλλεται περισσότερο, παρουσιάζοντας τη μεγαλύτερη αναστολή της δραστικότητας (>95%) με τα εντομοκτόνα dieldrin και spiromesifen, ενώ οι μικρότερες τιμές IC50 παρατηρήθηκαν στους 370C και σε pH 6,5, οι οποίες ήταν 17,9 ± 1,7 μΜ και 12,1 ± 3,4 μΜ αντίστοιχα. Οι ενώσεις αυτές αλληλεπιδρούν με το ένζυμο, στην περιοχή δέσμευσης των υποστρωμάτων (G- και H-περιοχή) του ενεργού κέντρου και συμπεριφέρονται σαν αναστολείς μικτού-τύπου (Ki 2,3±0.1 και 0,1±0,01 μΜ, έναντι GSH και CDNB, αντίστοιχα). Οι πρότυπες καμπύλες οι οποίες σχεδιάστηκαν (σταθερή απόκλιση 4,1%), με γνωστές συγκεντρώσεις των δύο εντομοκτόνων, επιτρέπουν τον ακριβή ποσοτικό προσδιορισμό τους σε δείγματα νερού, με αποτελέσματα συγκρίσιμα της HPLC μεθόδου. Από την παρούσα μελέτη φαίνεται ότι το ισοένζυμο hGSTA1-1, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη νέων απλών μεθόδων αναλυτικού προσδιορισμού φυτοπροστατευτικών με ικανοποιητική ακρίβεια, συνδυάζοντας χαμηλό κόστος και ελάχιστη προετοιμασία δείγματος. Οι μεταφοράσες της γλουταθειόνης (GSTs) που απαντούν στα φυτά, αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια από ισοένζυμα, τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπιση συνθηκών καταπόνησης και στην αποτοξίνωση ξενοβιοτικών. Τέσσερα GST ισοένζυμα από φύλλα του φυτού P.vulgaris, αλληλουχήθηκαν και η ανάλυση των cDNA έδειξε υψηλή ομολογία με GSTs των τάξεων τ (tau) και φ (phi). Στη συνέχεια εκφράστηκαν σε E. coli και καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας. Ακολούθησε προσδιορισμός της ειδικής δραστικότητας των ισοενζύμων έναντι 20 διαφορετικών υποστρωμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ισοένζυμα GSTs καταλύουν μεγάλο εύρος αντιδράσεων και επιδεικνύουν ευρεία εκλεκτικότητα. Πραγματοποιήθηκε μοριακή μοντελοποίηση και ανάλυση της δομής, ώστε να αναγνωριστούν τα δομικά χαρακτηριστικά, να κατανοηθεί η εξειδίκευση υποστρώματος και ο καταλυτικός μηχανισμός αυτών των ενζύμων. Τα αποτελέσματα αυτά έδωσαν νέα στοιχεία σχετικά με την καταλυτική και δομική ετερογένεια των GSTs του P. vulgaris.Η μελέτη δραστικότητας φανέρωσε την ποικιλομορφία που χαρακτηρίζει αυτά τα ισοένζυμα, ως προς την εξειδίκευσή τους. Για το κάθε ισοένζυμο υπήρξε διαφορετικό καλύτερο υπόστρωμα, με τα ισοένζυμα PvGSTU1-1, PvGSTU2-2, PvGSTU3-3 και PvGSTF1-1, να παρουσιάζουν μεγαλύτερη δραστικότητα, ως προς τα υποστρώματα ισοθειοκυανικό αλλυλ-εστέρα, 4-χλωρο-7-νιτροβενζο-2-οξο-1,3-διαζόλιο, 1-χλώρο-2,4-δινιτροβενζόλιο και 2,2 διθειοδιαιθανόλη, αντίστοιχα. Δομικές αναλύσεις έδειξαν ότι οι PvGSTs μοιράζονται ίδια χαρακτηριστικά με άλλες κυτταροπλασματικές φυτικές GSTs, με διαφορές στο ενεργό τους κέντρο και στη C-τελική περιοχή, καθώς και στον σύνδεσμο των N- και C- τελικών περιοχών. Η ετερογένεια που παρατηρήθηκε στη C-τελική περιοχή, φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την διαφορετική εξειδίκευση στις PvGSTs. Τα παραπάνω ισοένζυμα όμως που μελετήθηκαν, δεν έδειξαν ικανοποιητική ευαισθησία αναστολής, ως προς φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Έτσι, έχοντας ως σκοπό την ανάπτυξη βιοαισθητήρα ανίχνευσης και προσδιορισμού φυτοπροστατευτικών προϊόντων, αποφασίστηκε η εφαρμογή μεθόδων πρωτεϊνικής μηχανικής, ώστε να διευρυνθεί η δυνατότητα ευρέσεως νέων ενζύμων GSTs, με ικανοποιητική ευαισθησία ως προς τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Για το σκοπό αυτό καταπονήθηκαν φυτά P.vulgaris και G.max, θέλοντας να επαχθεί η έκφραση των GSTs, απομονώθηκε RNA με σκοπό τη δημιουργία cDNA βιβλιοθήκης. Χρησιμοποιώντας κατάλληλους εκφυλισμένους εκκινητές και PCR, απομονώθηκαν GST γονίδια από φύλα, βλαστό και ρίζα. Τα GST γονίδια υποβλήθηκαν σε in vitro κατευθυνόμενη εξέλιξη (DNA shuffling). H βιβλιοθήκη νέων GST γονιδίων που προέκυψε, κλωνοποιήθηκε σε φορέα κατάλληλο για έκφραση σε E. coli. Σάρωση της βιβλιοθήκης, οδήγησε στην επιλογή μιας νέας μορφής GST ενζύμου, που ανήκει στην τ τάξη. Το νέο αυτό ένζυμο (PvGmGSTUG) καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας και μελετήθηκε κινητικά. Επίσης ελέγχθηκε η εκλεκτικότητά του, ως προς 20 υποστρώματα και 66 φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Το ένζυμο αυτό εμφανίζει υψηλή δράση μεταφοράσης και υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης. Μελετώντας τα διαφορετικά φυτοπροστατευτικά προϊόντα, βρέθηκαν κυρίως τα οργανοχλωριωμένα εντομοκτόνα και οι στρομπιλουρίνες (μυκητοκτόνα), να είναι ισχυροί αναστολείς του ενζύμου. Η ευαισθησία του ενζύμου ως προς τα φυτοπροστατευτικά βελτιώθηκε περαιτέρω, εφαρμόζοντας κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση κορεσμού στη θέση Phe117 της αμινοξικής αλληλουχίας. Τελικά προέκυψαν επτά νέες μεταλλαγμένες μορφές, οι οποίες σε γενικές γραμμές διατήρησαν παρόμοια κινητική συμπεριφορά με αυτόν του ενζύμου PvGmGSTUG, παρουσιάζοντας όμως βελτίωση ως προς τη συγγένεια του με τη GSH. Η μορφή Phe117Ile εμφάνισε 5-φορές υψηλότερη καταλυτική αποτελεσματικότητα και μεγαλύτερη ευαισθησία έναντι της ομάδας των οργανοχλωριωμένων εντομοκτόνων. Συνεπώς, η μορφή Phe117Ile χρησιμοποιήθηκε για την μελέτη κατασκευής οπτικού βιοαισθητήρα. Το ένζυμο ακινητοποιήθηκε σε σύστημα sol-gel αλκοξυσιλανίων (TEOS/PTMOS), το ίδιο και οι δείκτες pH bromocresol purple (όξινος) και phenol red (βασικός). Έτσι με σύστημα δύο διαφορετικών εγκλωβισμών, αναπτύχθηκε αναλυτική μέθοδος προσδιορισμού του ισομερούς α-endosulfan. To σύστημα εμφανίζει γραμμικότητα στην περιοχή pH=4-7 στα 562 nm. Πρότυπη καμπύλη για το α-endosulfan σχεδιάστηκε σε εύρος συγκέντρωσης 0-30 μM.