Αναζήτηση ειδικών αυτοαντισωμάτων στη ρευματοειδή αρθρίτιδα με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης (νέες τεχνικές)

Abstract

Rheumatoid Arthritis (RA), the most commonly occurring autoimmune disorder, if untreated leads progressively to permanent joint damage and disability. Early therapeutic intervention may prevent progression of joint destruction, however for the initiation of an aggressive treatment more sensitive and specific diagnostic tests are required. In 1987 the American College of Rheumatology (ACR) in addition to clinical criteria, proposed the Rheumatoid Factor (RF) as the only serological diagnostic marker. This marker lacks specificity and has very low sensitivity in the early stages of the disease. In order to meet the need for improved diagnostic and prognostic tests various biomarkers and autoantibodies have being assessed. Among them, only the anti-Cyclic Citrullinated Peptide (anti-CCP) has gained wide acceptance and was included in 2010, in the ACR/EULAR classification criteria for RA. Aim of the study The aim of this study is the detection and measurement of several biomarkers and autoantibodies in Greek patients with RA, the evaluation of their role in the diagnosis of RA and the prediction of the evolution of an inflammatory arthritis to RA. In addition we have investigated their importance in the prognosis of the course of the disease, the response to therapeutic protocols and their use in routine clinical practice, with the formation of an algorithm. Patients and Methods A total of 426 patients were included in the study. Of those 278 (64.4%) were diagnosed as having RA (group A) and 148 (34.6%) suffered from other autoimmune or inflammatory diseases (group B) such as Systemic Lupus Erythematosus (N=31), Mixed Connective Tissue Disease (N=4), Polyarthritis Syndrome (N=47), Seronegative Spondylarthritis (N=36) and Idiopathic Inflammatory Bowel Disease (N=30). Moreover, 32 blood donors were included as healthy controls. As a special category 131 the 47 patients with Polyarthritis Syndrome, 17 (36.2%) of whom developed RA during a six months’ follow up, were studied. The laboratory tests applied in the serum samples of the patients and controls included: 1) the measurement of RF, of C-Reactive Protein (CRP) and of complement factors C3, C4 by nephelometry, 2) the titration of antinuclear (ANA) and anti-double stranded DNA (anti-dsDNA) using indirect immunofluorescence, 3) the detection of autoantibodies to extractable nuclear antigens (anti-ENA) using the method of ELISA and Immunoblotting, and 4) the anti-RA33, anti-CCP2, anti-CCP3.1, anti-MCV antibodies as well as and the RF IgG, IgM and IgA classes, using ELISA. For the statistical analysis of the results the program SPSS 18.0 and STATA 8.0, were used. Results 1. The comparison of group A patients with RA versus group B showed the following results : a) The presence of positive ANA and anti-RA33 antibodies or of abnormal CRP values does not differ significantly between the two groups of patients. b) Anti-ENA antibodies were detected in 47 (16.8%) of 279 samples studied. There was no significant difference in the percentages of positive anti-Ro (SSA) antibodies between the two groups. However the investigation of the specificity of the anti-Ro antibodies for the antigenic epitopes (Ro52, Ro60) showed a higher percentage of anti-Ro52 antibodies in the group A samples in comparison with group B (57.14% vs 21.4%, p= 0.025). c) The percentage of RA patients with positive anti-CCP2, anti-CCP3.1, anti-MCV antibodies and abnormal RF values was significantly higher in group A in comparison to group B patients (p< 0.001). 2. Concerning the criteria of sensitivity and specificity it was shown that anti-CCP2 antibodies have a higher sensitivity (88.1%), whereas anti-MCV antibodies presented a higher specificity (86.3%) compared to the other markers. As a prognostic tool for RA, anti-CCP2 antibodies are a more powerful predictor of disease course (90.4%). 132 3. In assessing the predictive significance of the various diagnostic tests regarding the evolution of the prospective cohort of patients with polyarthritis syndrome which evolved into RA (within a six months period) it was shown that all parameters tested had a prognostic value. However CRP had a significantly lower predictive capacity in comparison to anti-CCP2 (p=0.016) and anti-CCP3.1 (p=0.029), whereas there was no difference in the predictive power of other antibodies. 4. Comparing the values of RF Ig classes, CRP and anti-CCP2 between patients with RA and healthy controls it was shown that anti-CCP2, IgA and IgM RF had a higher prognostic capacity than IgG RF or CRP (p<0.05). Another finding was that the comparison of parameters studied between patients with early RA diagnosis (<2 years) and those with a delayed diagnosis (>2 years), showed no significant difference regarding any of those parameters. 5. The index for disease activity (DAS28) was not shown to be significantly correlated with CRP, RF or anti-CCP2 levels whereas a positive correlation was found with the levels of anti-MCV antibodies (r=0.69, p<0.001). The investigation of the effect of treatment in patients with RA and follow up for a 2 years period showed no significant change in the levels of any of the parameters studied following treatment interventions. Conclusions The anti-CCP2 antibodies have a higher prognostic value for RA patients in comparison to patients with other non RA diseases or healthy subjects. The RF has also a significant predictive power for RA in comparison to non RA diseases and for the progression of polyarthritis syndrome to RA within a six months’ period following diagnosis. Its prognostic capacity is however lower than that of anti-CCP2. Thus it appears that the combination of both markers is of great importance for the diagnosis, prognosis and prediction of the course of RA. Moreover the higher specificity of anti-MCV antibodies for RA compared to non RA diseases and the positive correlation of the levels of the anti-MCV with the changes of DAS28 suggests that they represent the most important marker for assessing disease activity and a useful tool for patient management and treatment decisions.

Η Ρευματοειδής Αρθρίτιδα (ΡΑ), η πιο κοινή φλεγμονώδης αυτοάνοση διαταραχή, χαρακτηρίζεται από προοδευτική καταστροφή των αρθρώσεων, ως αποτέλεσμα της χρόνιας υμενίτιδας. Η σοβαρή ανικανότητα και η σημαντική υποβάθμιση της ποιότητας της ζωής των ασθενών, αποτελούν συχνές συνέπειες της νόσου, υποδεικνύουν δε ότι η πρόληψη της μη αναστρέψιμης βλάβης των αρθρώσεων, θα πρέπει να είναι ο κύριος θεραπευτικός στόχος. Η βέλτιστη όμως θεραπευτική στρατηγική, η οποία θα πρέπει να ξεκινά όσο το δυνατόν νωρίτερα, προϋποθέτει την πρόσβαση σε κατάλληλα διαγνωστικά και προγνωστικά εργαλεία. Το 1987, το Αμερικάνικο Κολέγιο Ρευματολογίας (ACR) θέσπισε κριτήρια για την ταξινόμηση της ΡΑ και συμπεριέλαβε ως μοναδικό ορολογικό δείκτη, τον Ρευματοειδή Παράγοντας (ΡΠ), η παρουσία του οποίου όμως στερείται ειδικότητας και έχει χαμηλή ευαισθησία κυρίως στα πρώιμα στάδια της νόσου. Έτσι το ενδιαφέρον στράφηκε στην αναζήτηση και άλλων δεικτών με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, κατάλληλων τόσο για τη διάγνωση όσο και για την παρακολούθηση της πορείας της νόσου. Τα αντισώματα που στρέφονται έναντι των κιτρουλλιωμένων πρωτεϊνών/πεπτιδίων (αντι-CCPs) φαίνεται να εκπληρώνουν αυτές τις απαιτήσεις και από το 2010, σύμφωνα και με τις οδηγίες των ACR / EULAR, έχουν συμπεριληφθεί στα κριτήρια ταξινόμησης της ΡΑ. Σκοπός Σκοπός λοιπόν της παρούσας μελέτης είναι ο προσδιορισμός και η αξιολόγηση ορολογικών και ανοσολογικών παραμέτρων σε Έλληνες ασθενείς με ΡΑ και η εκτίμηση του ρόλου τους στη διάγνωση της ΡΑ ή/και στη πρόβλεψη εξέλιξης μιας αρθρίτιδας, σε ΡΑ. Επιπλέον, η διερεύνηση της αξίας τους στην πρόγνωση της πορείας της νόσου καθώς και στην ανταπόκριση στα νέα θεραπευτικά σχήματα (βιολογικούς ή μη παράγοντες). Επίσης, στόχο μας αποτελεί ο σχεδιασμός ενός αλγορίθμου στη αναζήτηση αλλά και αξιολόγηση αυτών των παραμέτρων, με δυνατότητα εφαρμογής στην καθημερινή κλινική πρακτική. 127 Ασθενείς και Μέθοδοι Η μελέτη συμπεριλαμβάνει δείγματα από 426 ασθενείς, εκ των οποίων οι 278 (64,4%) με διάγνωση ΡΑ (Ομάδα Α) και οι 148 (34,6%) με διάγνωση άλλου, εκτός ΡΑ, αυτοάνοσου ή ανοσολογικής φύσεως νόσημα (Ομάδα Β) και συγκεκριμένα, 31 με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ), 4 με Μικτή Νόσο του Συνδετικού Ιστού (ΜΝΣΙ), 47 με Πολυαρθρικό Σύνδρομο (ΠΣ), 36 με Οροαρνητικές Σπονδυλοαρθροπάθειες (ΟΣ) καθώς και 30 ασθενείς με Ιδιοπαθή Φλεγμονώδη Νοσήματα του Εντέρου (ΙΦΝΕ). Επιπλέον, 32 δείγματα υγιών ατόμων (αιμοδότες), αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Επίσης, μια ξεχωριστή κατηγορία μελέτης αποτέλεσαν 47 ασθενείς με αρχική διάγνωση Πολυαρθρικού Συνδρόμου, 17 (36,2%) εκ των οποίων ανέπτυξαν ΡΑ σε χρονικό διάστημα 6 μηνών από την πρώτη επίσκεψη στον κλινικό γιατρό. Οι εργαστηριακοί παράμετροι που αναζητήθηκαν στα δείγματα των ασθενών αφορούσαν τα επίπεδα του Ρευματοειδούς Παράγοντα (ΡΠ), της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) και των C3, C4 παραγόντων του συμπληρώματος, με νεφελομετρία, ενώ προσδιορίστηκαν οι τίτλοι των αντιπυρηνικών (ΑΝΑ) και των έναντι διπλής έλικας DNA αντισωμάτων (αντι-dsDNA) με έμμεσο ανοσοφθορισμό, τα επίπεδα των αντι-dsDNA με ραδιανοσολογική μέθοδο-RIA, τα αντισώματα έναντι εκχυλιζόμενων αντιγόνων του πυρήνα (αντι-ΕΝΑ) με ELISA και ανοσοαποτύπωση, ενώ τα αντι-RΑ33, αντι-CCP2, αντι-CCP3.1 και αντι-MCV αντισώματα καθώς και τα επίπεδα των τάξεων IgG, IgA και IgM του ΡΠ, με ELISA. Οι μέσες τιμές (mean), οι τυπικές αποκλίσεις (Standard Deviation=SD), οι διάμεσοι (median) και τα ενδοτεταρτημοριακά εύρη (interquartile range) χρησιμοποιήθηκαν για την περιγραφή των ποσοτικών μεταβλητών, οι απόλυτες (Ν) και οι σχετικές (%) για την περιγραφή των ποιοτικών μεταβλητών, ενώ για τη σύγκριση αναλογιών χρησιμοποιήθηκε το Pearson’s χ2 test ή το Fisher's exact test. Για τη σύγκριση ποσοτικών μεταβλητών χρησιμοποιήθηκε το μη παραμετρικό κριτήριο Mann-Whitney και για την εκτίμηση της προγνωστικής αξίας των αντισωμάτων χρησιμοποιήθηκε ROC καμπύλη από την οποία υπολογίστηκε η επιφάνεια (AUC) με 128 το 95% διάστημα εμπιστοσύνης της (95%CI). Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν τα στατιστικά προγράμματα SPSS 18.0 και STATA 8.0. Αποτελέσματα 1. Η σύγκριση των ευρημάτων μεταξύ των ασθενών των ομάδων Α και Β έδωσε τα κάτωθι αποτελέσματα: α. Η παρουσία θετικών ANA και αντι-RA33 αντισωμάτων καθώς και παθολογικών τιμών CRP δεν φαίνεται να διαφέρει σημαντικά μεταξύ των ασθενών των 2 ομάδων, p=0,536, 0,410 και 0,559, αντίστοιχα. β. Θετικά αντι-ΕΝΑ ανιχνεύτηκαν σε 47 (16,8%) από τα 279 δείγματα που μελετήθηκαν. Δεν βρέθηκε όμως κάποια σημαντική διαφορά στα ποσοστά των θετικών αντι-Ro (SSA) αντισωμάτων στις 2 ομάδες μελέτης (p=0.804). Η αναζήτηση όμως της ειδικότητας των αντι-Ro (SSA) αντισωμάτων, έναντι των δύο αντιγονικών επιτόπων (Ro52, Ro60) της πρωτεΐνης, ανέδειξε σημαντικά μεγαλύτερο ποσοστό των αντι-Ro52 αντισωμάτων στα δείγματα της ομάδας Α συγκριτικά με το αντίστοιχο ποσοστό των αντι-Ro52 στα δείγματα της ομάδας Β (57,14% vs. 21,4%, p=0.025). γ. Τα ποσοστά των ασθενών με ΡΑ που εμφάνισαν θετικά αντι-CCP2, αντι-CCP3.1, αντι-MCV και παθολογικές τιμές ΡΠ ήταν σημαντικά υψηλότερα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ποσοστά της ομάδας Β (p<0,001). 2. Αναφορικά με την ευαισθησία και την ειδικότητα των αντισωμάτων, τα αντι-CCP2 εμφανίζουν την υψηλότερη ευαισθησία (88,1%), ενώ την υψηλότερη ειδικότητα τα αντι-MCV (86,3%) σε σύγκριση με τους λοιπούς δείκτες. Επίσης, στα πλαίσια της αναζήτησης του καλύτερου προγνωστικού δείκτη για τη ΡΑ, τα αντι-CCP2 αντισώματα εμφανίζουν την υψηλότερη θετική προγνωστική αξία (90,4%). 3. Σημαντική προγνωστική ικανότητα όμως και για την εξέλιξη του ΠΣ σε ΡΑ, μέσα στους πρώτους 6 μήνες από την αρχική διάγνωση, εμφανίζουν όλες οι παράμετροι. Συγκεκριμένα, η CRP έχει σημαντικά χαμηλότερη προγνωστική ικανότητα σε σύγκριση με τα CCP2 (p=0,016) και CCP3.1 (p=0,029), ενώ δεν βρέθηκε διαφορά στη σύγκριση της προγνωστικής αξίας μεταξύ των υπολοίπων αντισωμάτων. 129 4. Συγκρίνοντας τα επίπεδα των τάξεων του ΡΠ, της CRP και των αντι-CCP2 μεταξύ ασθενών με ΡΑ και υγιείς, βρέθηκε ότι η προγνωστική ικανότητα των αντι-CCP2, καθώς και των IgA και IgM ΡΠ ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση από αυτή του IgG ΡΠ και της CRP (p<0.05). Επίσης, η σύγκριση των μέσων τιμών ±SD των παραμέτρων μεταξύ των ασθενών με πρόσφατη ΡΑ (<2 έτη) και αυτών με διάγνωση νόσου > 2 έτη δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά για καμία παράμετρο. 5. Η μεταβολή του δείκτη ενεργότητας της νόσου (DAS28) δεν βρέθηκε να συσχετίζεται σημαντικά με τα επίπεδα των αντι-CCP2, του ΡΠ και της CRP ενώ βρέθηκε σημαντική θετική συσχέτιση με τα επίπεδα των αντι-MCV αντισωμάτων (r=0,69, p<0,001). Επίσης, ο βαθμός μεταβολής των επιπέδων όλων των παραμέτρων δεν φαίνεται να επηρεάζεται από το θεραπευτικό σχήμα που ακολουθούσαν οι ασθενείς για το χρονικό διάστημα 2 ετών που μελετήθηκε. Συμπεράσματα Τα αντι-CCP2 αντισώματα εμφανίζουν την υψηλότερη προγνωστική ικανότητα για τη ΡΑ τόσο σε σχέση με άλλα μη ΡΑ νοσήματα, όσο και σε σχέση με τους υγιείς. Σημαντική καταγράφεται η προγνωστική ικανότητα του ΡΠ τόσο για τη ΡΑ σε σύγκριση με άλλα μη ΡΑ νοσήματα, όσο και για την εξέλιξη του Πολυαρθρικού Συνδρόμου σε ΡΑ μέσα στους πρώτους 6 μήνες από την αρχική διάγνωση, υπολείπεται όμως της προγνωστικής ικανότητας των αντι-CCP2. Έτσι και οι δύο παράμετροι φαίνεται να αποτελούν αξιόλογους δείκτες για την πρόγνωση, τη διάγνωση αλλά και την πρόβλεψη της εξέλιξης της νόσου. Επιπλέον, η υψηλότερη ειδικότητα (83,3%) των αντι-MCV αντισωμάτων για τη ΡΑ σε σχέση με τα μη ΡΑ νοσήματα καθώς και η θετική συσχέτιση της μεταβολής του DAS28 με τη μεταβολή του επιπέδου των αντι-MCV αντισωμάτων, τα αναδεικνύει ως μοναδικό αξιόπιστο δείκτη για την παρακολούθηση της δραστηριότητας της νόσου, απαραίτητο εργαλείο για τον κλινικό γιατρό στη λήψη αποφάσεων αναφορικά με τη διατήρηση ή τροποποίηση του θεραπευτικού σχήματος για τον ασθενή με ΡΑ. 130