Μελέτη του μηχανισμού συμβολής του ογκοκατασταλτικού γονιδίου ATM στην ογκογένεση στο στόμα

Abstract

Introduction: The oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common carcinoma (90%) in the oral cavity. It is the sixth most common malignancy and a major cause of morbidity and mortality by cancer worldwide. Despite the advances in treatment, including surgery, chemotherapy and radiotherapy, there has not been any important improvement in the prognosis over the last four decades. The most important causative factors are tobacco exposure and alcohol consumption. Oral carcinogenesis is a multi-step procedure in which genetic events lead to disruption of normal regulatory pathways that control basic cellular functions. These genetic events include chromosomal disturbances, activation of oncogenes and inactivation of tumor suppressor genes, as well as DNA methylation. Therefore, the understanding of the molecular mechanisms involved in initiation and progression of oral cancer will help in the improvement of its prognosis and the development of new forms of treatment. The “ataxia telangiectasia mutated” gene, ATM, is a tumor suppressor gene which is responsible for the disease ataxia telangiectasia. This gene codes for a protein kinase, which acts as a tumor suppressor protein by triggering appropriate cellular response to genome damage resulting from chemical carcinogen exposure or ionizing radiation. When ATM kinase is inactive, cells become prone to a flow of oncogenetic events eventually leading to cancer. Purpose: The purpose of the present thesis is the detection of the most common known mutation 7636del9 as well as the investigation of the methylation status of ATM promoter in genetic material from OSCC patients and healthy subjects without malignancy. This gene was selected due to the major role it plays in cell cycle arrest after DNA damage, DNA repair and oncogenesis, in general. Materials and Methods: 67 unrelated OSCC patients and 57 healthy blood donors (controls who represent the general population) were studied, of equivalent age, ethnicity, and gender. The molecular detection of 7636del9 mutation in 124 DNA samples was effected through a combination of PCR. digestion with the restriction enzyme Xba I and gel electrophoresis. The detection of the methylation status of ATM promoter included bisulphate modification of 100 DNA samples (50 OSCC patients and 50 healthy controls) and amplification of the modified samples by methylation-specifìc PCR (MSP) using two pairs of primers, one complementary to the unmethylated DNA sequence (U) and one complementary to the methylated DNA sequence (M). Results: The 7636del9 deletion was not detected in any sample from the 124 DNA samples examined. All OSCC patients as well as the healthy subjects were homozygous for the normal allele. In regard to the methylation status of ATM promoter, statistically significant differences were observed between the methylation status of patients and controls. In the total group of patients, the frequency of the methylated allele (76%), as well as the frequencies of heterozygotes (16%) and homozygotes (68%) for the methylated allele were found increased compared to the homozygotes for the unmethylated allele (OR 28.31, 95% CI 5.04-158.93, P<0.001). Similarly, the frequency of heterozygotes was significantly higher compared to the frequency of homozygotes for the unmethylated allele (OR 5.72, 95% CI 0.77-42.21, P<0.001). Similar results were obtained during the comparison of the distribution of alleles and genotypes between the various subcategories of patients (cancer stage, family history of cancer, tobacco abuse and alcohol consumption) and the control group (P<0.001). Conclusions: The most common 7636del9 mutation was not associated with increased risk for oral cancer. Interestingly, the findings of the present study indicated that ATM promoter is a target for aberrant hypermethylation in oral cancer, based to the fact that the ATM promoter was found hyper methylated in a high percentage of oral cancer cases. ATM reduced function through genetic silencing is an attractive candidate mechanism which contributes to oral cancer and possibly, other types of cancer.

Εισαγωγή: Το ακανθοκυτταρικό καρκίνωµα στόµατος (ΑΚΣ) είναι το πιο συχνό καρκίνωµα (90%) στην στοµατική κοιλότητα. Είναι η έκτη πιο συχνή κακοήθεια και µια κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιµότητας από καρκίνο παγκοσµίως. Παρά τις προόδους στη θεραπεία, συµπεριλαµβανοµένης της χειρουργικής επέµβασης, της χηµειοθεραπείας και της ακτινοθεραπείας, δεν έχει πραγµατοποιηθεί σηµαντική βελτίωση της πρόγνωσης τις τελευταίες τέσσερις δεκαετίες. Οι σηµαντικότεροι αιτιολογικοί παράγοντες πρόκλησης ΑΚΣ είναι ο καπνός και η κατανάλωση αλκοόλ. Η στοµατική καρκινογένεση είναι µια πολυσταδιακή διεργασία στην οποία γενετικά συµβάντα οδηγούν στη διαταραχή των φυσιολογικών ρυθµιστικών οδών που ελέγχουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Σε αυτά τα γενετικά συµβάντα συµπεριλαµβάνονται χρωµοσωµικές διαταραχές, η ενεργοποίηση ογκογονιδίων και η απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων καθώς και η υπερµεθυλίωση του DNA. Εποµένως, η κατανόηση των µοριακών µηχανισµών που εµπλέκονται στην έναρξη και εξέλιξη του καρκίνου του στόµατος θα βοηθήσουν στη βελτίωση της πρόγνωσής του και την ανάπτυξη νέων µορφών θεραπείας. Το “µεταλλαγµένο γονίδιο της αταξίας τηλαγγειεκτασίας” ΑΤΜ (ataxia-telangiectasia-mutated) είναι το γονίδιο που ευθύνεται για την ασθένεια αταξία τηλαγγειεκτασία. Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί µια πρωτεϊνική κινάση, η οποία λειτουργεί ως ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη πυροδοτώντας την κατάλληλη κυτταρική απόκριση στη βλάβη του γονιδιώµατος που προκύπτει από έκθεση σε χηµικά καρκινογόνα ή ιονίζουσα ακτινοβολία. Όταν η κινάση ΑΤΜ είναι ανενεργή, τα κύτταρα γίνονται επιδεκτικά σε µια ροή ογκογενετικών συµβάντων που τελικά οδηγούν σε καρκίνο. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανίχνευση της συχνότερης γνωστής μεταλλαγής 7636del9 καθώς επίσης και η διερεύνηση της κατάστασης μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου ATM σε γενετικό υλικό ασθενών με καρκίνο του στόματος και υγιών ατόμων χωρίς κακοήθεια. Η επιλογή αυτού του γονιδίου βασίστηκε στον κυρίαρχο ρόλο που επιτελεί αυτή η κινάση στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου ύστερα από βλάβη στο DNA, στην επιδιόρθωση του DNA και γενικότερα, στο ρόλο της στην ογκογένεση. Υλικά και Μέθοδοι: Μελετήθηκαν 67 μη σχετιζόμενοι ασθενείς με ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα στόματος και 57 υγιείς αιμοδότες (μάρτυρες οι οποίοι αντιπροσωπεύουν το γενικό πληθυσμό), με αντιστοιχία εθνικότητας, φύλου και ηλικίας. Η μοριακή ανίχνευση της μετάλλαξης 7636del9 σε συνολικά 124 δείγματα DNA πραγματοποιήθηκε με συνδυασμό PCR, πέψης με το ένζυμο περιορισμού Xbal και ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης. Η ανίχνευση της κατάστασης μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου ATM περιελάμβανε τροποποίηση 100 δειγμάτων DNA (50 ασθενείς καρκίνου του στόματος και 50 υγιείς μάρτυρες) με όξινο διθειώδες ιόν και ενίσχυση των τροποποιημένων δειγμάτων με ειδική για τη μεθυλίωση PCR (MSP) χρησιμοποιώντας δύο ζεύγη εκκινητών, ένα συμπληρωματικό της μη μεθυλιωμένης αλληλουχίας του DNA (U) κι ένα συμπληρωματικό της μεθυλιωμένης αλληλουχίας (Μ). Αποτελέσματα: Η έλλειψη 7636del9 δεν ανιχνεύτηκε σε κανένα από τα 124 δείγματα DNA που μελετήθηκαν. Όλοι οι ασθενείς με καρκίνο του στόματος καθώς επίσης και οι υγιείς μάρτυρες ήταν ομοζυγώτες για το φυσιολογικό αλληλόμορφο. Όσον αφορά την κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου ATM, παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ της κατάστασης μεθυλίωσης των ασθενών και των υγιών ατόμων. Στη συνολική ομάδα των ασθενών, η συχνότητα του μεθυλιωμένου αλληλομόρφου (76%), καθώς και οι συχνότητες τόσο των ετεροζυγωτών (16%) όσο και των ομοζυγωτών (68%) του μεθυλιωμένου αλληλομόρφου ήταν αυξημένες σε σύγκριση με τους ομοζυγώτες του μη μεθυλιωμένου αλληλομόρφου (Ρ<0.001). Η συχνότητα των ομοζυγωτών για το μεθυλιωμένο αλληλόμορφο ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με τη συχνότητα των ομοζυγωτών για το μη μεθυλιωμένο αλληλόμορφο (OR 28.31, 95% CI 5.04-158.93, Ρ<0.001). Παρομοίως, η συχνότητα των ετεροζυγωτών ήταν σημαντικά μεγαλύτερη της συχνότητας των ομοζυγωτών για το μη μεθυλιωμένο αλληλόμορφο (OR 5.72, 95% CI 0.77-42.21, Ρ<0.001). Αντίστοιχα δεδομένα προέκυψαν κατά τη σύγκριση της κατανομής των συχνοτήτων των αλληλομόρφων και των γονότυπων ανάμεσα στις διάφορες υποομάδες των ασθενών (στάδιο καρκίνου, οικογενειακό ιστορικό καρκίνου, ιστορικό καπνίσματος και αλκοόλ) και την ομάδα των υγιών μαρτύρων Ρ<0.001). Συμπεράσματα: Η συχνότερη μεταλλαγή 7636del9 δε συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του στόματος. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι τα ευρήματα της παρούσας μελέτης υπέδειξαν ότι ο υποκινητής του ΑΤΜ είναι στόχος ανώμαλης υπερμεθυλίωσης στον καρκίνο του στόματος, βάσει του γεγονότος ότι ο υποκινητής του ATM βρέθηκε υπερμεθυλιωμένος σε μεγάλο ποσοστό των περιστατικών με καρκίνο του στόματος. Η μειωμένη λειτουργία του ATM μέσω επιγενετικής αποσιώπησης αποτελεί έναν ελκυστικό υποψήφιο μηχανισμό συμβολής στον καρκίνο του στόματος και, ενδεχομένως, σε άλλους τύπους καρκίνου.