Μελέτη υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων των όγκων σε καρκίνο ωοθηκών: συσχέτιση με την παραγωγή κυτταροκινών και διερεύνηση της προγνωστικής τους σημασίας

Abstract

IntroductionEpithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death among gynecological malignancies and the fourth most common cause of cancer-related deaths among women. In the majority of cases the disease is diagnosed in advanced stages (International Federation of Gynecology and Obstetrics [FIGO] stages III and IV). Current treatment includes surgical cytoreduction and post-surgery platinum–paclitaxel chemotherapy. Despite the initial response to treatment, relapse (and death from the disease) will still occur in 70% of patients. Established prognostic factors for EOC include stage, volume of residual disease after cytoreductive surgery, histologic subtype and tumor grade. Nevertheless, given the fact that most cases are diagnosed at advanced stages, with tumors of high grade, the prognostic value of these factors is limited. Therefore, there is a need for the identification of new prognostic factors, which could probably be useful in the decision-making process. Ovarian carcinoma may be recognized and attacked by the immune system. Ovarian cancer antigens provoke an immune response which results in lymphocytic infiltration of the tumor. Recent data support that the presence of tumor-infiltrating lymphocytes and cytokines has been associated with immunoregulation and prognosis in ovarian cancer. Most patients with advanced ovarian cancer have ascites. An abundant quantity of cancer cells, lymphocytes and ascitic fluid can easily be obtained by abdominal paracentesis. Ascitic cell subpopulations and ascitic cytokines levels are parts of the intraperitoneal model employed in studying ovarian cancer. This model may recapitulate the immune events against ovarian cancer that take place in the human in a more accurate way than mouse models or cell cultures.Objective The aim of this study was to investigate:A) differences in VEGF (vascular endothelial growth factor), TNF-α (tumor necrosis factor-α), IFN-γ (interferon-gamma), IL-10 (interleukin-10) and IL-12 (interleukin-12) levels as well as in lymphocytic subpopulations between ascitic fluid and serum of patients with epithelial ovarian cancerB) the association of cytokines in the ascites from patients with ovarian cancer with these lymphocytic subpopulations C) the association of the results to be found with the platinum resistance and the prognosis of these patientsPatients and methodsFrom June 2004 to December 2006, samples of ascites and peripheral blood from 64 patients with ovarian cancer were obtained. Ascites was obtained at initial diagnosis in 42 cases (40 of them FIGO stage III). In the remaining 22 cases, ascites was obtained at the time of relapse. Cell subpopulations from peripheral blood and ascites were stained with monoclonal antibodies and analyzed by flow cytometry to determine cell type and immunophenotype. Flow cytometry analyses were performed on a three-colour fluorescence cytometer. VEGF (vascular endothelial growth factor), TNF-α (tumor necrosis factor-α), IFN-γ (interferon-gamma), IL-10 (interleukin-10) and IL-12 (interleukin-12) in ascites and serum of the 64 patients and 9 controls were measured by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).ResultsCD3+CD56+ and CD4+CD25+ (hi) cells were significantly higher in ascites than blood from ovarian cancer patients (p=0,004 and p=0,03 respectively). CD3+CD56+ (NK-like T) were also selectively accumulated in ascites from ovarian cancer compared with controls (p=0,011). VEGF, TNF-α and IL10 were significantly higher in ascites than in serum in ovarian cancer patients (p<0,001, p=0,042 and p<0,001 respectively). VEGF levels were significantly higher in ascites from ovarian cancer than from controls (p<0.001), while IL-12 was significantly lower in ascites from ovarian cancer than from cirrhotic ascites (p= 0,029). Serum VEGF and IL-12 levels were also significantly higher among ovarian cancer patients compared to controls (p < 0,001 both). VEGF ascites levels were inversely correlated with CD3+CD56+ cells in ascites (rho=−0.316, p=0.012). A similar inverse correlation was observed between TNF-α ascites levels and CD4+CD25+ (hi) cells in ascites (rho=−0.332, p=0.041). Among patients receiving first-line chemotherapy, VEGF levels <1900 pg/ml and TNF-α levels >35 pg/ml were associated with platinum sensitivity (p=0.026 both) and improved progression-free survival (PFS) (p=0.007 and p=0.036, respectively). VEGF levels <1900 pg/ml were also associated with improved overall survival (p=0.026). Overall survival was also longer for patients with high TNF-α levels, but this difference did not reach statistical significance (p=0.154).ConclusionsVEGF and TNF-α ascites levels are associated with prognosis in advanced ovarian cancer. Their association with immunologically important populations, namely the CD3+CD56+ (NK T-like) cells and the CD4+CD25+ (hi) (Tregs) cells, respectively may account for their prognostic significance in advanced ovarian cancer. This may probably be useful in making therapeutic decisions.

ΕισαγωγήΟ επιθηλιακός καρκίνος των ωοθηκών είναι η πρώτη αιτία θανάτου από γυναικολογικό καρκίνο και η τέταρτη αιτία θανάτου από καρκίνο συνολικά στο γυναικείο πληθυσμό. Η νόσος διαγιγνώσκεται στην πλειοψηφία των περιπτώσεων σε προχωρημένο στάδιο (III-IV κατά FIGO). Η καθιερωμένη θεραπεία περιλαμβάνει τη χειρουργική ογκομείωση και τη συμπληρωματική χημειοθεραπεία με συνδυασμό πλατίνας-ταξάνης. Παρά, όμως, τον αρχικό έλεγχο της νόσου αυτή υποτροπιάζει σε ποσοστό 70%. Καθιερωμένοι προγνωστικοί παράγοντες είναι το στάδιο, η υπολειπόμενη νόσος μετά την ογκομειωτική επέμβαση, ο ιστολογικός τύπος και ο βαθμός διαφοροποίησης. Επειδή οι περισσότεροι όγκοι κατά τη διάγνωση είναι ήδη χαμηλής διαφοροποίησης και προχωρημένου σταδίου, χρειάζεται η ανάδειξη νέων προγνωστικών παραγόντων που να βοηθούν σε θεραπευτικές αποφάσεις.Το ανοσολογικό σύστημα μπορεί να αναγνωρίζει τον ωοθηκικό καρκίνο και να του επιτίθεται. Τα αντιγόνα του καρκίνου των ωοθηκών προκαλούν ανοσολογική απάντηση με αποτέλεσμα τη διήθηση του όγκου από λεμφοκύτταρα. Πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα συνδέουν την ύπαρξη διηθούντων τον όγκο λεμφοκυττάρων και παραγόμενων κυτταροκινών με την ανοσορρύθμιση και με την πρόγνωση του επιθηλιακού ωοθηκικού καρκίνου.Οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών προχωρημένου σταδίου έχουν ασκίτη με αποτέλεσμα την εύκολη λήψη μεγάλου αριθμού καρκινικών κυττάρων, λεμφοκυττάρων και υγρού. Η μελέτη των κυτταρικών υποπληθυσμών και των κυτταροκινών στον ασκίτη αποτελεί πιστή αντανάκλαση της ανοσολογικής συμπεριφοράς έναντι του όγκου στην κλινική πραγματικότητα και όχι μόνο σε συνθήκες εργαστηρίου λόγω της επιλεκτικής ενδοπεριτοναϊκής ανάπτυξης του ωοθηκικού καρκίνου. Σκοπός της μελέτης Με βάση τα παραπάνω δεδομένα ο σκοπός της μελέτης περιέλαβε: Α) την εντόπιση διαφορών των παραγόντων VEGF, IL-10, IL-12, IFN-γ και TNF-α καθώς και των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών μεταξύ ασκιτικού υγρού και αίματος ασθενών με επιθηλιακό ωοθηκικό καρκίνο Β) την συσχέτιση των επιπέδων των κυτταροκινών με τους κυτταρικούς πληθυσμούς Γ) την συσχέτιση των παραπάνω ευρημάτων με κλινικούς παράγοντες, όπως η αντοχή στην πλατινούχο θεραπεία και η πρόγνωση των ασθενών αυτών Ασθενείς και ΜέθοδοιΑπό τον Ιούνιο του 2004 έως τον Δεκέμβριο του 2006 συγκεντρώθηκαν δείγματα ασκιτικού υγρού και περιφερικού αίματος από 64 ασθενείς με ωοθηκικό καρκίνο. Στις 42 περιπτώσεις ο ασκίτης συνελέγη από νεοδιαγνωσθέντα ωοθηκικό καρκίνο (οι 40 από αυτές σταδίου III κατά FIGO). Στις υπόλοιπες 22 περιπτώσεις ο ασκίτης προερχόταν από ωοθηκικό καρκίνο σε φάση υποτροπής. Επιπλέον συλλέχθηκαν δείγματα από 9 ασθενείς που έπασχαν από ηπατική κίρρωση τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Η μελέτη των υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων έγινε με φαινοτυπική ανάλυση με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού μέσω κυτταρομετρίας ροής σε κυτταρόμετρο τριών φθοριζουσών ουσιών – χρωμάτων.Στον ορό και το ασκιτικό υγρό των 64 ασθενών και των 9 μαρτύρων μετρήθηκαν ο VEGF (vascular endothelial growth factor), ο TNF-α (tumor necrosis factor-α),η IFN-γ (interferon-gamma), η IL-10 (interleukin-10) και η IL-12 (interleukin-12). Η μέτρησή τους έγινε με την μέθοδο ELISA.Αποτελέσματα Οι αριθμοί των CD3+CD56+ και των CD4+CD25+(hi) κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότεροι στον ασκίτη σε σχέση με το αίμα των ασθενών με ωοθηκικό καρκίνο (p=0,04 και p=0,03 αντίστοιχα). Παρατηρήθηκε επίσης εκλεκτική συγκέντρωση CD3+CD56+( NK-like T) κυττάρων στο ασκιτικό υγρό ασθενών σε σχέση με τον ασκίτη από ασθενείς με ηπατική κίρρωση (p=0,011). O VEGF, ο TNF-α και η IL-10 βρέθηκαν σε σημαντικά υψηλότερες τιμές στον ασκίτη σε σχέση με το αίμα ασθενών με ωοθηκικό καρκίνο (p<0,001, p=0,042 και p<0,001 αντίστοιχα). Tα επίπεδα του VEGF βρέθηκαν σημαντικά υψηλότερα στον ασκίτη ασθενών με ωοθηκικό καρκίνο σε σχέση με τον ασκίτη μαρτύρων (p<0.001), ενώ αντίθετα η IL-12 ήταν σημαντικά χαμηλότερη στον ασκίτη από καρκίνο έναντι του κιρρωτικού ασκίτη (p= 0,029). Ο VEGF και η IL-12 βρέθηκαν σημαντικά αυξημένοι στον ορό των ασθενών με καρκίνο ωοθηκών σε σύγκριση προς τους μάρτυρες (p < 0,001 αμφότεροι). Τα επίπεδα του VEGF στον ασκίτη συσχετίστηκαν αρνητικά με τα CD3+CD56+ κύτταρα σε αυτόν (rho = -0,316, p = 0,012), ενώ παρόμοια αρνητική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των επιπέδων του TNF-α στον ασκίτη και των CD4+CD25+(hi) κυττάρων σε αυτόν (rho = -0,332, p = 0,041). Μεταξύ ασθενών που έλαβαν χημειοθεραπεία 1ης γραμμής, επίπεδα στον ασκίτη VEGF <1900 pg/ml και TNF-α >35 pg/ml συσχετίστηκαν με ευαισθησία στην πλατίνη (p=0.026 αμφότερα) και με αυξημένη ελεύθερη-υποτροπής επιβίωση (PFS) (p=0.007 και p=0.036 αντίστοιχα). Επιπρόσθετα επίπεδα στον ασκίτη VEGF <1900 pg/ml συσχετίστηκαν με αυξημένη συνολική επιβίωση (p=0,026). Η συνολική επιβίωση υπήρξε μακρύτερη και για όσες ασθενείς είχαν τιμές TNF-α στον ασκίτη τους >35 pg/ml, αλλά η διαφορά αυτή δεν έφθασε τη στατιστική σημαντικότητα (p=0,154).ΣυμπεράσματαTα επίπεδα του VEGF και του TNF-α στον ασκίτη σχετίζονται με την πρόγνωση στον προχωρημένο καρκίνο ωοθηκών. Η σχέση τους με ανοσολογικώς δραστικούς κυτταρικούς πληθυσμούς στον ασκίτη, δηλαδή με τα CD3+CD56+ (NK-like T) και τα CD4+CD25+ (hi) (Tregs) κύτταρα αντιστοίχως, ενδεχομένως να ευθύνεται για την προγνωστική σημασία του VEGF και του TNF-α στον προχωρημένο ωοθηκικό καρκίνο και αυτό να βοηθά στη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων.