Ρύθμιση της λειτουργίας πρωτεϊνικών κινασών από την Cdc37 και την ομάδα των συνοδών πρωτεϊνών

Abstract

The main functions of chaperone proteins include the correct folding of newly synthesized proteins, the formation of protein complexes and the prevention of aggregates formation by misfolded proteins. Among the chaperone proteins, the most significant and well studied are HSP90 and its co-chaperone Cdc37. Recently it was shown by our lab that HSP90 is localized not only in the cytoplasm, but also in the cell surface of mouse melanoma and human mammary breast cancer cells and it is involved in cancer cell invasion and metastasis. The aims of this study was to investigate the possible presence of Cdc37, the main co-chaperone of HSP90, on the cell surface of cancer cells, the investigation of possible interactions with receptor tyrosine kinases as well as the participation of Cdc37 and other chaperones in metastasis. In this study, Cdc37 was detected on the cell surface of breast cancer cells MDA-MB 453 and MDA-MB 231, by immunofluorescence and Western blot. Then, by using an experimental method namely wound healing assay, it was illustrated that Cdc37 participates in cancer cell invasion, in vitro. Co-immunoprecipitation experiments revealed that cell surface Cdc37 interacts with surface HSP90 as well as with receptor tyrosine kinases HER-2 and EGFR. The formation of the multi protein complex HSP90-Cdc37-HER-2/EGFR seems to be important for the downstream signal transduction through the MAP kinases and Akt pathways. Furthermore, by using the zymography technique, it was shown that extracellular HSP90 is necessary for the activation of MMP-2 and MMP-9 metalloproteinases. In vivo experiments with immunodeficient SCID mice revealed that inhibition of cell surface HSP90 by the monoclonal antibody mAb 4C5 reduces the metastatic deposits and metastatic formations in the lungs. Finally, the effect of grape extract in breast cancer cells was examined. In these experiments it was shown that the expression of Cdc37 and HSP70 is altered and cells are driven to apoptosis. The data from the present thesis suggest an extracellular chaperoning system of receptor tyrosine kinases by Cdc37 and HSP90, which contributes to the regulation of these receptors and participates in the mechanisms of invasion and metastasis of cancer cells.

Κύρια λειτουργία των συνοδών πρωτεϊνών είναι η σωστή αναδίπλωση των νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών, ο σχηματισμός πρωτεϊνικών συμπλόκων και η παρεμπόδιση σχηματισμού συσσωμάτων από μη λειτουργικές πρωτεΐνες. Από τα κυριότερα μέλη των συνοδών πρωτεϊνών και εκτενέστερα μελετημένη είναι η HSP90 και η συν-συνοδή της πρωτεΐνη Cdc37. Προσφάτως, έχει δειχθεί από το εργαστήριο μας πως η HSP90 εντοπίζεται όχι μόνο στο κυτταρόπλασμα αλλά και στην επιφάνεια των μελανωμάτων ποντικού και καρκινικών κυττάρων μαστού και εμπλέκεται στo μηχανισμό διήθησης και μετάστασης καρκινικών κυττάρων. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να μελετηθεί η πιθανή παρουσία της Cdc37, η κυριότερη συν-συνοδή πρωτεΐνη της HSP90, στην επιφάνεια καρκινικών κυττάρων, να μελετηθούν οι πιθανές αλληλεπιδράσεις της με τους υποδοχείς κινάσης τυροσίνης καθώς και η συμμετοχή τόσο της Cdc37 όσο και άλλων συνοδών μορίων σε μεταστατικά φαινόμενα. Στην παρούσα διατριβή, εντοπίστηκε, η Cdc37 στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων μαστού MDA-MB 453 και MDA-MB 231 με τη χρήση ανοσοσοφθορισμού και ανοσοαποτύπωσης. Ακολούθως, χρησιμοποιώντας την πειραματική διαδικασία ¨επούλωσης της πληγής¨ δείχθηκε in vitro πως η επιφανειακή Cdc37 συμμετέχει στη διήθηση των συγκεκριμένων καρκινικών κυττάρων. Η επιφανειακή Cdc37 αλληλεπιδρά με την επιφανειακή HSP90 καθώς επίσης και με τους υποδοχείς κινάσης τυροσίνης HER-2 και ΕGFR όπως φάνηκε από πειράματα συν-ανοσοκατακρύμνισης. Ο σχηματισμός του πρωτεϊνικού συμπλόκου HSP90-Cdc37-HER-2/EGFR φαίνεται πως είναι αναγκαίος για την καταρροϊκή μεταγωγή σήματος μέσω των MAP κινασών και της Akt. Επιπλέων, δείχθηκε πως η εξωκυττάρια HSP90 είναι αναγκαία για την ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεασών MMP-2 και MMP-9, χρησιμοποίωντας τη τεχνική της ζυμογραφίας. Σε in vivo πειράματα χρησιμοποιώντας ανοσοσκατασταλμένα SCID ποντίκια φάνηκε πως η αναχαίτιση της επιφανειακής HSP90 από το μονοκλωνικό αντίσωμα mAb 4C5 μειώνει την δημιουργία μεταστατικών αποθέσεων και μεταστατικών εστιών στους πνεύμονες των πειραματόζωων. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση εκχυλίσματος σταφυλιού σε καρκινικά κύτταρα, όπου φάνηκε πως μεταβάλλεται η έκφραση των Cdc37 και HSP70, ενώ τα κύτταρα οδηγούνται σε απόπτωση. Τα δεδομένα από την παρούσα διατριβή, υποστηρίζουν την ύπαρξη ενός εξωκυττάριου συστήματος συνοδείας των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης από την Cdc37και την HSP90, το οποίο συμμετέχει στη ρύθμιση της λειτουργιάς των υποδοχέων αυτών και συμμετέχει στους μηχανισμούς διήθησης και μετάστασης των καρκινικών κυττάρων.