Διερεύνηση του ρόλου της autotaxin και της μεταγωγής σήματος από φωσφολιπίδια στην ανάπτυξη και παθοφυσιολογία του νευρικού συστήματος

Abstract

Autotaxin (ATX), originally isolated from melanoma cells as a potent cell motility-stimulating factor, is a secreted lysophospholipase D that converts lysophosphatidyl choline (LPC) to lysophosphatidyl Acid (LPA). LPA, an important lipid mediator, plays a crucial role in various neuronal developmental processes, including neurogenesis, neuronal migration, neuritogenesis and myelination. ATX mRNA expression is first detected at the floor plate of the neural tube at embryonic day 9.5 (E9.5), to reach widespread expression postnatally, with highest mRNA levels detected in brain, ovary and intestine. Enhanced ATX expression has been repeatedly demonstrated in a variety of malignant tumor tissues, including tumors of the central nervous system such as glioblastoma and neuroblastoma. To uncover the physiological role of ATX and LPA signalling in vivo we generated a conditionally inactivated allele by homologous recombination in embryonic stem cells (ES) using the Cre-LoxP system. To induce germ line, complete inactivation of ATX, ATXfl/fl mice were mated with transgenic mice overexpressing the Cre recombinase under the control of the human CMV minimal promoter. ATX-/- mice die at E9.5 with vascular defects in the yolk sac and severe malformations of the nervous system (open neural tube, asymmetric head folds, swollen alantois). We observe a dramatic increase in apoptosis accompanied by decrease in proliferation within the developing nervous system. Taken together, these results imply that ATX has antiapoptotic and a proliferative effect during neural development. The dorsal-ventral patterning is unaffected in Autotaxin null embryos. However neuronal differentiation is dramatically impaired but it can be rescued by LPA administration. Moreover, expression profiling using microarray data shows significant reduction of hypoxia inducible factor-1alpha (Hif1a). In the present study, we used mouse embryo fibroblasts to show that upon LPA stimulation there is expression of Hif1a. Previous studies suggest that in SCs, LPA exerts its survival effect through LPA receptor(s)-mediated Gi/o/PI3K/Akt survival pathways. Akt activity and Hif-1 are both essential for development and implicated in tumor growth. Upon activation by products of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), Akt phosphorylates downstream targets that stimulate growth and inhibit apoptosis. We report here that, Akt was not expressed in ATX null embryos, indicating that Atx expression is necessary for the Hif-1 activation. These results indicate that ATX deficiency and LPA signaling plays a role in neuronal differentiation in the developing nervous system.

Η autotaxin (ATX) είναι μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη με ενζυμική δράση λυσοφωσφολιπάσης D, η οποία μετατρέπει τη λυσοφωσφατιδυλχολίνη σε λυσοφωσφολιπιδικό οξύ (LPA). Η πλήρη απαλοιφή της ATX σε ποντίκια έχει ως αποτέλεσμα την ελαττωματική αγγειοπλασία, ανωμαλίες στο νευρικό σωλήνα που οδηγούν σε εμβρυικό θάνατο ηλικίας περίπου 10.5 ημερών. Στην παρούσα εργασία εστιάσαμε την μελέτη του ρόλου της ATX και της σηματοδότησης φωσφολιπιδίων στην ανάπτυξη του νευρικού σωλήνα. Η δημιουργία ATX knockout ποντικού με την στοχευμένη απαλοιφή του γονιδίου της ΑΤΧ αποδεικνύει ότι η έκφραση της ΑΤΧ είναι απαραίτητη για την νευρογένεση αλλά και τη σωστή ανάπτυξη του νευρικού σωλήνα. Επιπλέον, παρατηρήσαμε δραματική αύξηση αποπτωτικών κυττάρων στην περιοχή του πρόσθιου και μέσου εγκέφαλου, η οποία συνοδεύεται από μειωμένο πολλαπλασιασμό στις συγκεκριμένες περιοχές του προς ανάπτυξη νευρικού συστήματος, γεγονότα τα οποία συσχετίζονται άμεσα με τις βιβλιογραφικές μελέτες για την επίδραση του LPA στα νευρικά κύτταρα κυρίως στην περιοχή του εγκεφάλου λόγω των υψηλών επιπέδων έκφρασης LPA. Παράλληλα, μελετήθηκε ο κοιλιακός-ραχιαίος άξονας, ο οποίος δεν προσβάλλεται από την έλλειψη έκφρασης της ΑΤΧ. Παρόλα αυτά η νευρωνική διαφοροποίηση έχει υποστεί βλάβη αλλά αποκαθίσταται μετά την προσθήκη λυσοφωσφατιδικού οξέος, το παράγωγο της ATX. Παράλληλα, για να εμβαθύνουμε στους μηχανισμούς που πιθανότατα συνεισφέρουν στον παρατηρούμενο φαινότυπο των συγκεκριμένων εμβρύων μετά από απαλοιφή της έκφρασης της ΑΤΧ, πραγματοποιήσαμε μελέτη μικροσυστοιχίας DNA μετά από απομόνωση ολικού RNA από φυσιολογικά έμβρυα 9,5 ημερών, δείγμα «ελέγχου» και από ATX knockout έμβρυα 9,5 ημερών, δείγμα προς μελέτη. Σε μια σειρά από γονίδια που βρέθηκαν απορυθμισμένα ήταν και αυτό για τον Hif1a. Τόσο με real time PCR αλλά όσο και με ανοσοιστοχημείες επιβεβαιώθηκε το αποτέλεσμα των μικροσυστοιχιών, υποδεικνύοντας ότι κατά την απουσία έκφρασης ATX και άρα LPA έχουμε έλλειψη έκφρασης του Hif1a παρότι δεν παρατηρούνται διαφορές στην ύπαρξη υποξίας μεταξύ των φυσιολογικών και γενετικά τροποποιημένων για την έκφραση της ΑΤΧ εμβρύων 9,5 ημερών.