Αναγνώριση των ενεργοποιημένων κινασών τυροσίνης και άλλων σημείων των οδών μεταγωγής σήματος με χημικούς παράγοντες που μπορούν να μετέχουν στη δημιουργία χρόνιων μυεολοϋπερπλαστικών συνδρόμων (ΧΜΥΣ)

Abstract

Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are clonal hematopoietic disorders resulting from the transformation of a hematopoietic stem cell (HSC), with abnormal amplification of one or several myeloid lineages. The classic MPNs comprise chronic myelogenous leukemia (CML), polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET), and primary myelofibrosis (PMF). Less frequent MPNs are chronic eosinophilic leukemia (CEL), hypereosinophilic syndrome (HES), chronic neutrophilic leukemia (CNL), chronic baseophilic leukemia (CBL), systemic mastocytosis (SM), and other unclassifiable MPNs. Pathogenesis of most MPNs involve the deregulation of a tyrosine kinase that mimics the physiological intracellular signaling pathways induced by hematopoietic cytokine receptors. Pathogenetic breakthroughs in MPN began in decade 1980 when fusion gene BCR-ABL were describe in CML where as the next decades were found many other fusion genew and point mutations that were related with the respective phenotype in MPN. JAK2V617F was the most important point mutation that was described in patients with PV, ET and PMF. The present thesis was focused in study of HES, which is a rare and heterogeneous group of disorders, and characterized by the following criteria according to WHO: (i) persistent blood eosinophilia >1500/μL for more than six months, (ii) exclusion of any secondary causes of eosinophilia such as allergy, parasitic infections, autoimmune diseases and cancer, and (iii) eosinophil organ damage, mainly skin, heart, lungs and nervous system. For this reason 160 samples of peripheral blood were collected from patients who fulfilled the above diagnostic criteria, and were examined for the JAK2V617F and CKITD816V point mutations and for the BCR-ABL, FIP1L1-PDGFRA, BCR-PDGFRB, ETV6-PDGFRB, BCR-FGFR1, ZNF198-FGFR1, CEP110-FGFR1 and FOP-FGFR1 fusion genes. 7 patients with mild eosinophilia were described to be positive for the JAK2V617F, 3 patients with mild eosinophilia were described to be positive for the CKITD816V where as in 4 patients with slightly leukocytosis and eosinophilia were described to be positive for FIP1L1-PDGFRA. The fusion genes BCR-ABL, BCR-PDGFRB, ETV6-PDGFRB, BCR-FGFR1, ZNF198-FGFR1, CEP110-FGFR1 and FOP-FGFR1 weren’t found in any patient. Patients who carry the fusion gene FIP1L1-PDGFRA followed a treatment with imatinib mesylate and had hematological, clinical and molecular remission within one month. Furthermore, 4 patients HES and 2 CEL followed a treatment with dasatinib because of unsuccessful treatment with corticosteroid, imatinib and hydroxyouria. 4 patients had hematological and clinical remission within two months. The molecular mechanisms that cause significantly increased eosinophil count are unknown. As a result patients have high mortality risk because of the accumulation of eosinophils in tissues. For these reasons, it is quite important to discover new molecular markers as therapeutic targets in HES. Proteomics is a useful technique that can provide a global description and identification of the proteins expressed in a cell at a certain time. Many genes can be activated or silenced in neoplasmatic states so there will be differences in protein expression levels. Such differences can be detected in 2-Dimentional Gel Electrophoresis. In the present study, we used a global proteomic approach by 2-Dimentional Gel Electrophoresis to identify the modification of proteome induced by F/P fusion gene in EOL-1 cell line comparing with the proteome of leukemic cell lines K562 (express BCR-ABL fusion gene), CCRF-CEM and HEL. Furthermore, the same approach was used to detect differences between the proteome of circulated monocytes from healthy volunteers and CEL patients (presence of F/P fusion gene), HES patients and CML patients. We show several differences in protein expression levels between the proteome of EOL-1 and K562, CCRF-CEM and HEL and identified 51, 35 and 35 proteins respectively. These proteins have different molecular functions such as structural proteins of cytoskeleton, metabolic enzymes and signal transducers. Followed the same approach, we analyze the proteome of circulated monocytes from 2 patients with eosinophilia that express F/P fusion gene, from 4 patients with unexplained eosinophilia (HES), from 4 patients that express BCR-ABL fusion gene (CML) and from 10 healthy volunteers. We compare the proteome between healthy volunteers and F/P patients, healthy volunteers and HES patients, HES patients and F/P patients, and HES patients with CML patients and emerge 34, 30 and 10 proteins with different expression levels. To conclude, HES is a rare hematologic disorder where pathological causes and molecular functions are unknown. Proteomic analysis provides the opportunity to investigate such molecular mechanisms, since it gives global information of genes that is being expressed by a cell in an abnormal or diseased state. So, proteins that were being identified and had different expression levels between healthy and diseased cells, might be used as disease markers or candidates for therapeutic intervention.

Τα Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα (ΜΥΝ) είναι κλωνικές αιμοποιητικές διαταραχές, που πλήττουν τα στελεχιαία αιμοποιητικά κύτταρα (hematopoietic stem cell, HSC) προκαλώντας το μη φυσιολογικό πολλαπλασιασμό ενός ή περισσότερων κυττάρων της μυελικής σειράς. Τα «τυπικά» ΜΥΝ περιλαμβάνουν τη χρόνια μυελογενή λευχαιμία (ΧΜΛ), την αληθή πολυκυτταραιμία (ΑΠ), την ιδιοπαθή θρομβοκυττάρωση (ΙΘ) και την ιδιοπαθή μυελοΐνωση (IM). Λιγότερο κοινά ΜΥΝ είναι η χρόνια ηωσινοφιλική λευχαιμία (ΧΗΛ), το υπερηωσινοφιλικό σύνδρομο (ΥΗΣ), η χρόνια ουδετεροφιλική λευχαιμία (ΧΟΛ), η χρόνια βασεοφιλική λευχαιμία (ΧΒΛ), η συστηματική μαστοκυττάρωση (ΣΜ) και τα άτυπα ΜΥΝ. Η παθογένεια των περισσότερων ΜΥΝ σχετίζεται με την απορύθμιση των κινασών τυροσίνης, οι οποίες απομιμούνται τη φυσιολογική ενδοκυτταρική σηματοδότηση που επάγεται από αυξητικούς αιμοποιητικούς παράγοντες. Η πρώτη ένδειξη γενετικής παθογένειας στα ΜΥΝ ήρθε τη δεκαετία του 1980 με την περιγραφή του χιμαιρικού γονιδίου BCR-ABL στη ΧΜΛ ενώ τις επόμενες δεκαετίες βρέθηκαν διάφορα χιμαιρικά γονίδια και σημειακές μεταλλάξεις που σχετίζονταν με τον αντίστοιχο φαινότυπο στα ΜΥΝ, με πιο σημαντική την ανίχνευση της σημειακής μετάλλαξης JAK2V617F κυρίως σε ασθενείς με ΑΠ, ΙΘ και IM. Η παρούσα διατριβή επικεντρώθηκε στην μελέτη του ΥΗΣ, που αποτελεί μια σπάνια και ετερογενή ομάδα διαταραχών και χαρακτηρίζεται από τα ακολούθα κριτήρια κατά ΠΟΥ/WHO: (i) αριθμός ηωσινόφιλων >1500/μL για περισσότερο από έξι μήνες, (ii) αποκλεισμός οποιασδήποτε δευτερογενούς αιτίας της αύξησης των ηωσινόφιλων κυττάρων, όπως αλλεργία, παρασιτικές μολύνσεις, αυτοάνοσα νοσήματα και καρκίνος, και (iii) βλάβη κάποιου οργάνου, κυρίως δέρμα, καρδιά, πνεύμονες και νευρικό σύστημα, εξαιτίας της συσσώρευσης ηωσινόφιλων κυττάρων. Για το σκοπό αυτό από το 2006-2011 συλλέχθηκαν συνολικά 160 δείγματα περιφερικού αίματος ασθενών, που πληρούσαν τα παραπάνω διαγνωστικά κριτήρια, και ελέγχθηκαν για την ύπαρξη των σημειακών μεταλλάξεων JAK2V617F και CKITD816V, καθώς και των χιμαιρικών γονίδιων BCR-ABL, FIP1L1-PDGFRA, BCR-PDGFRB, ETV6-PDGFRB, BCR-FGFR1, ZNF198-FGFR1, CEP110-FGFR1 και FOP-FGFR1. 7 ασθενείς με ήπια ηωσινοφιλία βρέθηκαν θετικοί για τη σημειακή μετάλλαξη JAK2V617F, 3 ασθενείς με ήπια ηωσινοφιλία βρέθηκαν θετικοί για τη σημειακή μετάλλαξη CKITD816V ενώ σε 4 ασθενείς με σημαντική λευκοκυττάρωση και ηωσινοφιλία διαπιστώθηκε η παρουσία του χιμαιρικού γονίδιου FIP1L1-PDGFRA. Σε κανένα από τα υπόλοιπα δείγματα δε βρέθηκαν τα χιμαιρικά γονίδια BCR-ABL, BCR-PDGFRB, ETV6-PDGFRB, BCR-FGFR1, ZNF198-FGFR1, CEP110-FGFR1 και FOP-FGFR1. Οι θετικοί ασθενείς για το χιμαιρικό γονίδιο FIP1L1-PDGFRA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το σκεύασμα imatinib mesylate και παρουσίασαν πλήρη αιματολογική και κλινική ύφεση μέσα σε διάστημα ενός μήνα. Επιπλέον, 4 ασθενείς με ΥΗΣ και 2 ασθενείς με ΧΗΛ, μετά από προηγουμένη ανεπιτυχή θεραπεία με κορτικοστεροειδή, imatinib και υδροξυουρία, έλαβαν το σκεύασμα dasatinib. 4 παρουσίασαν αιματολογική, κλινική και μοριακή ύφεση μέσα σε διάστημα δύο μηνών. Εξαιτίας των αδιευκρίνιστων μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην αύξηση του αριθμού των ηωσινόφιλων κυττάρων στο ΥΗΣ και του υψηλού κίνδυνου θανάτου των ασθενών λόγω συσσώρευσης των ηωσινόφιλων στους ιστούς αποτελεί ιδιαίτερα σημαντικό η εύρεση νέων μορίων στόχων για θεραπεία. Το σκοπό αυτό εκπληρώνει η πρωτεωμική. Με τον όρο πρωτεωμική εννοούμε την ταυτόχρονη μελέτη και ανάλυση του συνόλου των πρωτεϊνών που έχουν εκφραστεί σε ένα κύτταρο μια δεδομένη στιγμή. Σε περιπτώσεις νεοπλασματικής εκτροπής ορισμένα γονίδια θα ενεργοποιηθούν ή θα αποσιωπηθούν και θα αρχίσουν να εκφράζουν ή να μην εκφράζουν τα μηνύματα που κωδικοποιούν. Οι διαφορές αυτές αποτυπώνονται με την τεχνική της δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαμίδης (2D SDS-PAGE). Η τεχνική αυτή εφαρμόστηκε για τη συγκριτική ανάλυση του πρωτεώματος της ηωσινοφιλικής κυτταρικής σειράς EOL-1, που εκφράζει το χιμαιρικό γονίδιο FIP1L1- PDGFRA, με το πρωτέωμα των λευχαιμικών κυτταρικών σειρών Κ562 (εκφράζει το χιμαιρικό γονίδιο BCR-ABL), CCRF-CEM και HEL αλλά και για τη συγκριτική ανάλυση του πρωτεώματος των μονοκύτταρων φυσιολογικών μαρτύρων με το πρωτέωμα των μονοκυττάρων ασθενών με ΧΗΛ (παρουσία του χιμαιρικού γονίδιου FIP1L1-PDGFRA), ΥΗΣ και ΧΜΛ. Από τη σύγκριση του πρωτεώματος της κυτταρικής EOL-1 με το πρωτέωμα των κυτταρικών σειρών Κ562, CCRF-CEM και HEL ανεδείχθησαν διαφορές στην έκφραση 221, 202 και 202 πρωτεϊνών αντίστοιχα, από τις οποίες αναγνωρίστηκαν οι 51, 35 και 35 αντίστοιχα. Οι πρωτεΐνες αυτές ανήκουν σε διάφορες λειτουργικές ομάδες όπως πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού, πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε μεταβολικά μονοπάτια και στη μεταγωγή σήματος. Χρησιμοποιώντας την ίδια τεχνική, αναλύθηκε το πρωτέωμα των μονοπύρηνων κυττάρων του αίματος από 2 ασθενείς με ηωσινοφιλία με θετικό το χιμαιρικό γονίδιο FIP1L1- PDGFRA (F/P+), από 4 ασθενείς με ηωσινοφιλία ανεξήγητης αίτιας (ΥΗΣ), από 4 ασθενείς που έφεραν το χιμαιρικό γονίδιο BCR-ABL (Χρόνια Μυελογενή Λευχαιμία, ΧΜΛ) και από 10 φυσιολογικούς μάρτυρες. Η σύγκριση πραγματοποιήθηκε μεταξύ των φυσιολογικών μαρτύρων και των F/P+ ασθενών, μεταξύ των φυσιολογικών μαρτύρων και των ασθενών με ΥΗΣ, μεταξύ των F/P+ ασθενών και των ασθενών με ΥΗΣ και μεταξύ των ασθενών με ΥΗΣ και των ασθενών με ΧΜΛ και προέκυψαν 34, 30 και 10 πρωτεΐνες με διαφορική έκφραση. Συμπεραίνοντας, το ΥΗΣ αποτελεί μια σπάνια αιματολογική διαταραχή, όπου τα παθολογικά αίτια και οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται είναι αδιερεύνητα. Η πρωτεωμική ανάλυση επιτρέπει τη διερεύνηση τέτοιων μηχανισμών αφού δίνει μια συνολική εικόνα των γονίδιων που εκφράζονται ή αποσιωπούνται σε ένα κύτταρο εξαιτίας μιας μη φυσιολογικής κατάστασης. Επομένως, οι πρωτεΐνες που αναγνωρίστηκαν και είχαν διαφορική έκφραση σε σχέση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες αποτελούν πιθανούς διαγνωστικούς δείκτες ή θεραπευτικούς στόχους για την αντιμετώπιση των συμπτωμάτων.