Ανάλυση του μοριακού μηχανισμού έκκρισης τύπου ΙΙΙ στο εντεροπαθογόνο E. coli

Abstract

The type III secretion injectisome is a complex nanomachine, that allows bacteria to deliver protein effectors across eukaryotic cellular membranes. In recent years, significant progress has been made in our understanding of its structure, assembly and mode of operation. In the present stage of knowledge, it consists of a basal structure that traverses the bacterial envelope and the peptidoglycan, surmounted by a needle and a filament. The whole structure can act as a hollow conduit, through which all the virulence proteins will be delivered to the cytosol of the host. A key element in the secretion system is a set of chaperones in the bacterial cytosol, the dedicated type III chaperones. Their exact role in the secretion process remains ainigmatic. The main goal of this study is the investigation of the molecular role of the CesAB chaperone from the Enteropathogenic coli (EPEC) during secretion of its substrates, EspA and EspB. In parallel we are characterizing the EscN ATPase of the system, as a final acceptor of the soluble complexes between chaperones-substrates. Firstly, we are characterizing structurally the chaperone alone or in complex with its substrate and we reveal a novel mechamism of recognition, the mutual folding during binding of a substrate to its chaperone. In parallel with biochemical experiments, we are demonstrating that the CesAB chaperone consists of two distict, functionally and structurally, domains, the N-terminal domain (N-domain) and the C-terminal tail (C-tail). Through mutagenesis to the N-domain of the protein, we are clearly showing that this domain is responsible for the chaperone-like function of CesAB, only for EspA and not EspB substrate. Then we are demonstrating that the C-tail is absolutelly essential for the effective secretion of both substrates, not only because in the absence of the C-tail the substrates cannot be secreted, but also because they cannot be localized to the membrane fraction of the cell, their natural place before secretion. In addition, we are showing that the C-tail is involved in the formation of a super-molecular complex intracellularly in the secretion pathway. The physiological significance of these two domains of the CesAB chaperone is tested using cell models, and their importance for the pathogeneceity is revealed. Finally we are managing to isolate the stable active form of the EscN ATPase of the system and meisure affinity for the C-tail of the CesAB chaperone. The results of this study reveal very important key points for the secretion process of the two translocalots, EspA and EspB, through the type III secretion system of EPEC.

Το συρίγγιο τύπου ΙΙΙ είναι μια περίπλοκη νανομηχανή, η οποία επιτρέπει στα βακτήρια να μεταφέρουν τις τοξικές πρωτείνες τους διαμέσω των ευκαρυωτικών κυτταρικών μεμβρανών. Τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί μεγάλη πρόοδος ως προς την μελέτη της δομής του, της διαδικασίας της συναρμολόγησής του, αλλά κυρίως του τρόπου δράσης του. Με βάση την παρούσα γνώση, το συρίγγιο τύπου ΙΙΙ αποτελείται από το βασικό σωμάτιο, το οποίο διαπερνά τις βακτηριακές μεμβράνες και την πεπτιδογλυκάνη και συνεχίζει εξωκυτταρικά στη βελόνη και το ινίδιο. Όλη αυτή η δομή πιστεύεται πως δρα σαν ένας κενός δίαυλος διαμέσω του οποίου θα μεταναστεύσουν οι μολυσματικές πρωτείνες του βακτηρίου έως το κυτταρόπλασμα του ξενιστή τους. Κεντρικό ρόλο στη διαδικασία έκκρισης φαίνεται να παίζει επίσης και μια σειρά από εξειδικευμένες σαπερόνες του συστήματος ΙΙΙ. Παρά τις πρόσφατες μελέτες, ο ακριβής ρόλος τους στην εκκριτική διαδικασία παραμένει αινιγματικός. Σε αυτή τη μελέτη στοχεύουμε στη διερεύνηση του ρόλου της σαπερόνης CesAB από το εντεροποθογόνο E. coli (EPEC) κατά την έκκριση των υποστρωμάτων της EspA και EspB από το βακτηριακό κύτταρο. Παράλληλα χαρακτηρίζουμε την ΑΤΡάση του συστήματος EscN ως πιθανό τελικό αποδέκτη του συμπλόκου σαπερόνης-υπόστρωμα. Έτσι, αρχικά χαρακτηρίζουμε δομικά την πρωτείνη και αποκαλύπτουμε έναν νέο μηχανισμό αλληλεπίδρασης, όπου τόσο η CesAB όσο και το υπόστρωμά της, EspA, μεταπίπτουν από την φυσική τους μη-αναδιπλωμένη κατάσταση σε μια πλήρως αναδιπλωμένη κατά την διάρκεια και μόνο της αλληλεπίδρασης τους (mutual folding). Παράλληλα με βιοχημικά πειράματα δείχνουμε πως η σαπερόνη αποτελείται από δύο διακριτές λειτουργικά αλλά και δομικά περιοχές, την αμινο-τελική περιοχή (Ν-περιοχή) και την καρβοξυ-τελική ουρά (C-ουρά). Με τη δημιουργία σημειακών μεταλλαγών στην Ν-περιοχή αρχικά, δείχνουμε πως η περιοχή αυτή είναι υπεύθυνη για τη δράση της ως σαπερόνη στο υπόστρωμα EspA, αλλά όχι και στο EspB. Εν συνεχεία, αποκαλύπτουμε πως η C-ουρά είναι ζωτικής σημασίας για την έκκριση και των δύο υποστρωμάτων, καθώς όταν αυτή απουσιάζει όχι μόνο δε θα εκκριθούν αποτελεσματικά από το κύτταρο, αλλά και τα δύο υποστρώματα δε θα στοχευτούν στη μεμβράνη, τη φυσική τους θέση πριν από την έκκριση. Εξετάζοντας επιπλέον τον ρόλο της C-ουράς βρίσκουμε πως συμμετέχει στο σχηματισμό ενός υπερ-μοριακού εκκριτικού ενδιαμέσου. Η φυσιολογική σημασία των δύο υπο-περιοχών της CesAB ελέγχεται επίσης με τη χρήση κυτταρικών μοντέλων, εμπλέκοντας έμμεσα τις περιοχές αυτές στην παθογονικότητα του EPEC. Τέλος, εξετάζοντας και την σπουδαιότητα της ΑΤΡάσης του συστήματος κατά την έκκριση των υποστρωμάτων, προσδιορίζουμε την ενεργή της μορφή και μετρούμε τη συγγένειά της με την C-ουρά. Τα αποτελέσματα της διατριβής αυτής στοιχειοθετούν ένα σημαντικό πλαίσιο για την περαιτέρω διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού έκκρισης των δύο μεταθετών EspA και EspB από το EPEC.