Περίληψη
Οι βενζοδιαζεπίνες έχουν υπνωτικές, ηρεμιστικές και αντισπασμωδικές ιδιότητες και συχνά συναντώνται σε κλινικές και ιατροδικαστικές περιπτώσεις. Οι βενζοδιαζεπίνες είναι ανάμεσα στα πιο συχνά συνταγογραφούμενα φάρμακα για την αντιμετώπιση του άγχους, διαταραχές του ύπνου, και καταστάσεις επιληψίας. Από την άλλη τα τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά είναι τα πιο δημοφιλή για τη θεραπεία της κατάθλιψης. Για την ιατρική αντιμετώπιση της κατάθλιψης και της νέυρωσης, η χορήγηση βενζοδιαζεπινών και τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών είναι ευρέως χρησιμοποιούμενη.
Ο ποσοτικός προσδιορισμός φαρμακευτικών ουσιών σε βιολογικά δείγματα: αίμα, πλάσμα αίματος, ορό αίματος, ούρα, σάλιο κ.α. είναι μια διαδικασία απαραίτητη για αξιόπιστα τοξικολογικά αποτελέσματα και συμβουλευτική στήριξη στην κλινική και ιατροδικαστική τοξικολογία. Τα στοματικά υγρά (σάλιο) χρησιμοποιούνται σήμερα ως ένα ευκόλως διαθέσιμο εναλλακτικό του αίματος σε διάφορες εφαρμογές, όπως για έλεγχο θεραπευτικών φαρμάκων και ολοένα και ...
Οι βενζοδιαζεπίνες έχουν υπνωτικές, ηρεμιστικές και αντισπασμωδικές ιδιότητες και συχνά συναντώνται σε κλινικές και ιατροδικαστικές περιπτώσεις. Οι βενζοδιαζεπίνες είναι ανάμεσα στα πιο συχνά συνταγογραφούμενα φάρμακα για την αντιμετώπιση του άγχους, διαταραχές του ύπνου, και καταστάσεις επιληψίας. Από την άλλη τα τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά είναι τα πιο δημοφιλή για τη θεραπεία της κατάθλιψης. Για την ιατρική αντιμετώπιση της κατάθλιψης και της νέυρωσης, η χορήγηση βενζοδιαζεπινών και τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών είναι ευρέως χρησιμοποιούμενη.
Ο ποσοτικός προσδιορισμός φαρμακευτικών ουσιών σε βιολογικά δείγματα: αίμα, πλάσμα αίματος, ορό αίματος, ούρα, σάλιο κ.α. είναι μια διαδικασία απαραίτητη για αξιόπιστα τοξικολογικά αποτελέσματα και συμβουλευτική στήριξη στην κλινική και ιατροδικαστική τοξικολογία. Τα στοματικά υγρά (σάλιο) χρησιμοποιούνται σήμερα ως ένα ευκόλως διαθέσιμο εναλλακτικό του αίματος σε διάφορες εφαρμογές, όπως για έλεγχο θεραπευτικών φαρμάκων και ολοένα και περισσότερο για έλεγχο καταχρηστικών φαρμάκων σε διάφορες περιπτώσεις όπως για την επιβολή του νόμου, στον εργασιακό χώρο ή για ελέγχους στο δρόμο. Για τις βιο-φαρμακολογικές, κλινικές, τοξικολογικές ή ιατροδικαστικές εφαρμογές η διαθεσιμότητα γρήγορων, ευαίσθητων και εκλεκτικών μεθόδων για τον προσδιορισμό των φαρμάκων σε βιολογικά δείγματα είναι απαραίτητος. Για την πραγματοποίηση επιτυχημένων αναλύσεων, πρέπει να διατίθενται στον αναλυτή το συντομότερο δυνατό τα αντίστοιχα βιολογικά δείγματα, καθώς και να είναι διαθέσιμες οικονομικές και γρήγορες μέθοδοι με σύγχρονες τεχνικές (αέρια η υγρή χρωματογραφία). Παρόλο που η αέρια χρωματογραφία με φασματογράφο μαζών είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος αναφοράς, η υγρή χρωματογραφία με ανιχνευτή UV/DAD είναι η πρώτη επιλογή όσον αφορά στη διαθεσιμότητα στα εργαστήρια.
Η παρούσα διατριβή περιλαμβάνει περιγραφή της δομής και των ιδιοτήτων των εξεταζόμενων φαρμάκων (1,4-βενζοδιαζεπινών και τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών), των βασικών αρχών της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης και της Εκχύλισης Στερεάς Φάσης Υποστρώματος (SPE), βιβλιογραφική επισκόπηση σχετικά με την προκατεργασία των βιολογικών δειγμάτων και τις διάφορες αναλυτικές μεθόδους για τον προσδιορισμό τους.
Στο πειραματικό μέρος περιγράφονται λεπτομερώς τα αντιδραστήρια και τα όργανα που χρησιμοποιήθηκαν καθ’ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων, καθώς και οι πειραματικές διαδικασίες. Μια σύντομη συζήτηση πάνω στις παραμέτρους επικύρωσης παρατίθεται στο κεφάλαιο της επικύρωσης.
Ο στόχος της διατριβής ήταν η ανάπτυξη, επικύρωση και εφαρμογή τριών μεθόδων Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης σε φαρμακευτικά σκευάσματα και βιολογικά υγρά. Ο διαχωρισμός των φαρμάκων παρουσία κολχικίνης ως εσωτερικό πρότυπο πραγματοποιήθηκε σε μία χρωματογραφική στήλη Kromasil (C8-5 μm, 250 × 4 mm, 100), ενώ η κινητή φάση ήταν μίγμα CH3OH:0.05M, CH3COONH4:CH3CN με πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Οι προσδιοριζόμενες ενώσεις εκχυλίστηκαν από τα βιολογικά δείγματα σε μικροστήλες SPE Nexus Varian και ανιχνεύθηκαν με ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων στα 240 nm.
Πρώτο μέρος: Αναπτύχθηκε μία μέθοδος Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό έξι βενζοδιαζεπινών (αλπραζολάμης, βρωμαζεπάμης, κλοναζεπάμης, διαζεπάμης, φλουνιτροζεπάμης και λοραζεπάμης) σε φαρμακευτικά σκευάσματα και βιολογικά υγρά (πλάσμα αίματος και ούρα) μετά από Εκχύλιση Στερεάς Φάσης Υποστρώματος. Μετά από συσχέτιση του λόγου των εμβαδών των ενώσεων προς το εμβαδό του εσωτερικού προτύπου με τις συγκεντρώσεις βρέθηκε η γραμμική περιοχή της μεθόδου που κυμαινόταν από 0.20-15.00 ng μL-1 για κάθε βενζοδιαζεπίνη, εκτός από τη βρωμαζεπάμη, της οποίας η γραμμική περιοχή κυμαινόταν από 0.1-18.0 ng μL-1 με συντελεστή συσχέτισης μεγαλύτερο από 0.993. Οι ανακτήσεις και οι σχετικές τυπικές αποκλίσεις κυμαίνονταν από 92-111% και 0.1-3.1%, αντίστοιχα στα φαρμακευτικά σκευάσματα και δείγματα βιολογικών υγρών. Οι τιμές των ορίων ανίχνευσης (LOD) και των ορίων ποσοτικής αποτίμησης (LOQ) κυμαίνονταν από 0.03-0.17 ng μL-1 και 0.2-0.5 ng μL-1, αντίστοιχα.
Η μέθοδος εφαρμόστηκε σε πραγματικό δείγμα ούρων από ασθενή που υποβλήθηκε σε θεραπεία με αλπραζολάμη.
Δεύτερο μέρος: Αναπτύχθηκε μία μέθοδος Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό έξι 1,4-βενζοδιαζεπινών: βρωμαζεπάμης, κλοναζεπάμης, διαζεπάμης, φλουνιτραζεπάμης, λοραζεπάμης και αλπραζολάμης, καθώς και δύο μεταβολιτών: της α-υδρόξυαλπραζολάμης και α-υδρόξυτριαζολάμης σε δείγματα πλάσματος αίματος, ούρων και σάλιου μετά από προκατεργασία με Εκχύλιση Στερεάς Φάσης Υποστρώματος. Οι καμπύλες βαθμονόμησης ήταν γραμμικές στην περιοχή από 0.2-20 ng µL-1 στα πρότυπα διαλύματα εκτός από την αλπραζολάμη. Για την αλπραζολάμη στα πρότυπα, καθώς και για όλες τις προσδιοριζόμενες ενώσεις στα βιολογικά υγρά, η γραμμική περιοχή κυμαινόταν από 0.3-20.0 ng µL-1 με συντελεστή συσχέτισης μεγαλύτερο από 0.997.
Η σχετική τυπική απόκλιση των μετρήσεων επαναληψιμότητας στη διάρκεια μιας μέρας (n = 6) ήταν 0.2-1.3%, 0.3-1.9%, 0.4-1.6%, 0.4-1.7%, η σχετική τυπική απόκλιση των μετρήσεων επαναληπτικότητας στη διάρκεια έξι ημέρων (n = 6) ήταν 0.2-1.7%, 0.7-2.5%, 0.5-2.1%, 0.4-3.0% σε πρότυπα διαλύματα και δείγματα πλάσματος, ούρων και σάλιου αντίστοιχα. Οι αντίστοιχες μέσες τιμές των ανακτήσεων (επί τοις εκατό) ήταν 96.3-108.6, 96.0-108.2, 94.3-107.1, 97.0-107.0 % στις μετρήσεις επαναληψιμότητας στη διάρκεια μιας μέρας και 96.8-107.7, 94.6-107.6, 93.2-105.8, 96.0-108.6 % στις μετρήσεις επαναληπτικότητας στη διάρκεια έξι ημέρων. Οι τιμές των ορίων ανίχνευσης (LOD) και των ορίων ποσοτικής αποτίμησης (LOQ) κυμαίνονταν από 0.02-0.5 ng μL-1 και 0.07-1.6 ng μL-1, αντίστοιχα.
Τρίτο μέρος: Αναπτύχθηκε μία μέθοδος Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό έξι 1,4-βενζοδιαζεπινών και τριών τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών: αμιτριπτυλίνης, κλομιπραμίνης και δοξεπίνης σε φαρμακευτικά σκευάσματα και βιολογικά υγρά (πλάσμα αίματος και ούρα) μετά από Εκχύλιση Στερεάς Φάσης Υποστρώματος. Οι καμπύλες βαθμονόμησης ήταν γραμμικές, τόσο για τις 1,4-βενζοδιαζεπίνες, όσο και για τα τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά έως τα 20 ng µL-1 με συντελεστή συσχέτισης 0.999. Οι τιμές των ορίων ανίχνευσης (LOD) και των ορίων ποσοτικής αποτίμησης (LOQ) κυμαίνονταν από 0.1-1.2 ng µL-1 και 0.3-3.9 ng µL-1, αντίστοιχα. Οι μέσες τιμές των ανακτήσεων όλων των προσδιοριζόμενων ενώσεων σε όλα τα υποστρώματα κυμαίνονταν από 85-108.7% (n = 6) στις μετρήσεις επαναληψιμότητας στη διάρκεια μιας μέρας και 86-109.9% στις μετρήσεις επαναληπτικότητας στη διάρκεια έξι ημέρων, ενώ η ακρίβεια της μεθόδου ήταν ικανοποιητική με τις τιμές της σχετικής τυπικής απόκλισης να είναι μικρότερες του 4% .
Η κατεργασία του δείγματος ήταν πολύ απλή και οι μέθοδοι ήταν γρήγορες , απλές, εκλεκτικές, ευαίσθητες και επαναλήψιμες. Οι μέθοδοι που περιγράφηκαν θα μπορούσαν να αποτελέσουν ένα χρήσιμο εργαλείο στη φαρμακευτική χημεία, κατάλληλο τόσο για κλινική ανάλυση, όσο και για τον ποιοτικό έλεγχο φαρμακευτικών σκευασμάτων.
Η διαδικασία της εκχύλισης στερεάς φάσης βελτιστοποιήθηκε με την προσεκτική διαδοχική έκλουση των 1,4-βενζοδιαζεπινών με μίγμα μεθανόλης-ακετονιτριλίου η οποία ακολουθήθηκε από την έκλουση των τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών με μεθανόλη. Τόσο οι βενζοδιαζεπίνες, όσο και τα τρικυκλικά αντικαταθλιπτικά διαχωρίστηκαν ταυτόχρονα και ανιχνεύθηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες που αναπτύχθηκαν στην τρίτη μέθοδο. Τόσο η διαζεπάμη, όσο και η ιμιπραμίνη διαχωρίστηκαν επιτυχώς. Η μέθοδος εφαρμόστηκε επιτυχώς σε ανθρώπινα βιολογικά υγρά και οι ανακτήσεις των προσδιοριζόμενων ενώσεων κυμαίνονταν από 86-107% για το πλάσμα, τα ούρα και το σάλιο, ενώ οι τιμές της σχετικής τυπικής απόκλισης ήταν μικρότερες από 10%. Η διαδικασία ήταν απλή γρήγορη και αξιόπιστη με καλή ευαισθησία και ακρίβεια και είναι κατάλληλη για χρήση σε κλινικές αναλύσεις, όταν γίνεται διαδοχική χρήση βενζοδιαζεπινών και τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών και για αναλύσεις ρουτίνας στον έλεγχο ποιότητας για φαρμακευτικά σκευάσματα που περιέχουν δύο συστατικά.
Η επίδραση της μακρόχρονης αποθήκευσης στη σταθερότητα των έξι 1,4-βενζοδιαζεπινών αλπραζολάμης, βρωμαζεπάμης, κλοναζεπάμης, διαζεπάμης, φλουνιτραζεπάμης και λοραζεπάμης σε εμβολιασμένα δείγματα πλάσματος, ούρων, και σάλιου ελέγχθηκε σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα. Η ποσοτική αποτίμηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την πρώτη μέθοδο μετά από εκχύλιση στερεάς φάσης. Τα εμβολιασμένα δείγματα (0.5, 2.0 ng µL-1) αποθηκεύτηκαν στους -20°C και αναλύθηκαν σε επιλεγμένες χρονικές στιγμές κατά τη διάρκεια 180 ημερών για το πλάσμα και τα ούρα και 120 ημερών για το σάλιο. Στους -20°C στο τέλος της εξεταζόμενης χρονικής περιόδου η μείωση που παρατηρήθηκε ήταν της τάξης του 40% για τη φλουνιτραζεπάμη και τη κλοναζεπάμη και 20% των αρχικών επιπέδων εμβολιασμού για τις υπόλοιπες τέσσερις βενζοδιαζεπίνες. Στο τέλος της περιόδου μελέτης στις χαμηλές συγκεντρώσεις (0.5 ng µL-1) όλες οι βενζοδιαζεπίνες ήταν μεν ανιχνεύσιμες, αλλά ο μηχανισμός αποσύνθεσης τους δεν ήταν δυνατόν να εξακριβωθεί. Τα αποτελέσματα της μελέτης σταθερότητας κατά τη διάρκεια των κύκλων ψύξης-απόψυξης, έδειξαν ότι οι προσδιοριζόμενες ενώσεις ήταν σταθερές για πέντε κύκλους ψύξης-απόψυξης στο πλάσμα και τα ούρα και για τρεις κύκλους ψύξης-απόψυξης στο σάλιο. Επιπλέον η μελέτη σταθερότητας όλων των προσδιοριζόμενων ενώσεων στη διάρκεια ενός έτους έδειξε ότι τα πρότυπα μεθανολικά διαλύματα αποθηκευμένα στους 4oC μπορούν να χρησιμοποιηθούν χωρίς να έχουν υποστεί κάποια αξιοσημείωτη αλλοίωση.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Analytical chemistry; detection (qualitative) and quantitation (quantitative), of substances is not a new branch of science. There has been very rapid development of new methods of analysis, since the third or fourth decade of the century. In modern society the analytical chemists have a very important role to play. These developments have come largely through necessity in connection with rapid expansion of the industrial economy, as well as with extensive growth of research programmes in many varied fields. The nation’s health is safe-guarded by continual checking (analysis) of foods, drugs, cosmetics, water supplies, waste disposal methods etc. In hospitals chemical analysis is widely used to assist in the diagnosis of illness and in monitoring the condition of patients. Medical and biological research programmes depend on analysis of various kinds in broadening our knowledge of vital processes and in the development of therapeutic agents to combat disease. However, the recent increa ...
Analytical chemistry; detection (qualitative) and quantitation (quantitative), of substances is not a new branch of science. There has been very rapid development of new methods of analysis, since the third or fourth decade of the century. In modern society the analytical chemists have a very important role to play. These developments have come largely through necessity in connection with rapid expansion of the industrial economy, as well as with extensive growth of research programmes in many varied fields. The nation’s health is safe-guarded by continual checking (analysis) of foods, drugs, cosmetics, water supplies, waste disposal methods etc. In hospitals chemical analysis is widely used to assist in the diagnosis of illness and in monitoring the condition of patients. Medical and biological research programmes depend on analysis of various kinds in broadening our knowledge of vital processes and in the development of therapeutic agents to combat disease. However, the recent increase in reports of drug-facilitated crimes (sexual assault, robbery) has caused alarm in the general public. The drugs involved can be pharmaceuticals, such as benzodiazepines, hypnotics, sedatives or anaesthetics, serotonergic drugs, tricyclic antidepressants, drugs of abuse, such as cannabis, ecstasy. Benzodiazepines have hypnotic, tranquillizing and anticonvulsant properties and are frequently encountered in clinical and forensic science casework. Benzodiazepines are among the most frequently prescribed drugs for the treatment of anxiety, sleep disturbance and status epileptics. On the other hand tricyclic antidepressants are the most popular class of drugs in the treatment of depression. For the medical treatment of depression and neurosis, the concomitant administration of benzodiazepines and tricyclic antidepressants is widely practised.
Quantification of drugs in the bio-samples; blood, plasma, serum, urine, saliva etc. procedure is important prerequisites for competent toxicological judgment and consultation in clinical and forensic toxicology. Oral fluid (saliva) is used today as a readily available alternative to blood for some applications in therapeutic drug monitoring and increasingly for testing drugs of abuse in many environments, including law enforcement, workplace or roadside drug testing. For the bio-pharmacological, clinical, toxicological or forensic consequences the availability of rapid, high sensitive and selective analytical methods for their determination in biological fluids are essential. To perform successful examinations, analyst must obtain as soon as possible the corresponding biological specimens and subsequent analysis using sophisticated analytical techniques (gas or liquid chromatography) with time and cost effective methods. Though gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS) is the most widely used reference method but liquid chromatography coupled with UV/DAD is the first choice in consideration of their availability.
The dissertation comprises description on structure and properties of examined drugs (1,4-benzodiazepines and tricyclic antidepressants), basic concepts on HPLC and SPE, elaborate review on the biological sample preparation and different analytical methods adopted for their determination. Experimental section details the chemicals, instrumentations used throughout the experiments, experimental procedures. Brief discussion on validation parameters is presented in method validation chapter.
As the goal of dissertation three HPLC methods have been developed, validated and successfully applied to pharmaceuticals and bio-fluids. Separation of drugs in presence of colchicine as internal standard was performed on Kromasil (C8-5 μm, 250 × 4 mm, 100) analytical column using a mobile phase consisting CH3OH:0.05M,CH3COONH4:CH3CN under gradient program at ambient temperature. The analytes were extracted from biological samples by Nexus Varian SPE cartridges and detected by DAD set at 240 nm.
First: HPLC method has been developed for the simultaneous separation and quantification of six 1,4-benzodiazepines (alprazolam, bromazepam, clonazepam, diazepam, flunitrazepam, lorazepam) in pharmaceutical and biological matrices (human plasma, urine) after solid-phase extraction (SPE). The drug/internal standard peak area ratios were linked in quadratic relationships to its concentrations giving linearity range of 0.20-15.00 ng μL-1 for each BDZs except BRZ that of which is 0.1-18.0 ng μL-1 with coefficient of determination greater than 0.993. Recoveries and RSD were between 92-111% and 0.1-3.1%, respectively from pharmaceutical/biological samples. The limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) values were 0.03-0.17 ng μL-1 and 0.2-0.5 ng μL-1, respectively. The method was also applied to a real urine sample from a patient under treatment with alprazolam.
Second: HPLC method has been developed for the determination of six 1,4-benzodiazepines: bromazepam, clonazepam, diazepam, flunitrazepam, lorazepam, alprazolam, along with two metabolites: α-hydroxyalprazolam, α-hydroxytriazolam in human plasma, urine and saliva samples after SPE. Calibration curves were linear from 0.2-20 ng µL-1 in standard for all except alprazolam. For alprazolam in standard and for all analytes in biological fluids linear range was 0.3-20.0 ng µL-1 with coefficient of determination (r2) better than 0.997. The Within-day assay (n = 6) RSD were 0.2-1.3%, 0.3-1.9%, 0.4-1.6%, 0.4-1.7% and the between-day assay (n = 6) RSD were 0.2-1.7%, 0.7-2.5%, 0.5-2.1%, 0.4-3.0% for standard, plasma, urine and saliva, respectively. The percentage mean recoveries for all analytes were from 96.3-108.6, 96.0-108.2, 94.3-107.1, 97.0-107.0 in within-day analysis and from 96.8-107.7, 94.6-107.6, 93.2-105.8, 96.0-108.6 in between-day analysis for standard, plasma, urine and saliva, respectively. LOD and LOQ were in 0.02-0.5 and 0.07-1.6 ng µL-1, respectively.
Third: HPLC assay has been developed for the simultaneous determination of six 1,4-benzodiazepines as above combination with three tricyclic antidepressants, amitriptyline, clomipramine, doxepin, in pharmaceuticals and human plasma, urine, saliva after SPE. Calibration curves were linear for both 1,4-benzodiazepines and tricyclic antidepressants up to 20 ng µL-1 with coefficient of determination (r2) 0.999. LOD and LOQ were in 0.1-1.2 ng µL-1 and 0.3-3.9 ng µL-1, respectively. The mean recoveries of all analytes in all matrices were 85-108.7% (n = 6) for within-day and 86-109.9% (n=6) for between-day assays having good precision (RSD< 4%).
The sample preparation was very simple and methods were rapid, simple, selective and sensitive enough and reproducible. The methods described here would be useful tool in medicinal chemistry, suitable for use both in clinical analysis as well as for quality control of pharmaceutical formulations.
A solid-phase extraction procedure was optimized when a careful specific sequential elution was performed to elute 1,4-benzodiazepines from SPE using a mixture of methanol-acetonitrile (1:1) followed by the elution of tricyclic antidepressants with methanol. Both benzodiazepines (six) and tricyclic antidepressants (four) were simultaneously separated and detected using the same chromatographic conditions developed in third method. Both diazepam and imipramin, those overlapped each other under this chromatographic conditions, were successfully determined with losing their selectivity. Method was applied successfully in human fluids, and anlytes were determined with recoveries of 86-107% for plasma, urine and saliva having good precision (RSD) values less than 10%. The procedure is simple, fast and reliable with good specificity and sensitivity, will be suitable for use in a clinical setting, where there is a concomitant use of benzodiazepines and tricyclic antidepressants, and for routine analysis in quality control for two component tablet formulations.
The influence of long-term storage on the stability of six 1,4-benzodiazepines; alprazolam, bromazepam, clonazepam, diazepam, flunitrazepam and lorazepam in spiked plasma, urine and saliva samples was investigated at defined time intervals. Spiked samples (0.5, 2.0 ng µL-1) were stored at -20°C, and analysed at selected times during 180 days for both plasma and urine, and 120 days for saliva. Quantification was carried out using the method described in first method after SPE. At -20°C, at the end of the observation period the measured decrease was around 40% for flunitrazepam and clonazepam, and around 20% for remaining four benzodiazepines of the original levels. At end of study period for low concentrations (0.5 ng µL-1) all benzodiazepines were though detectable but a clear pattern of breakdown could not be established. Result of stability study through freeze-thaw cycle during seven successive days for spiked samples stored at -20°C revealed that analytes were completely stable up to five cycles in plasma, urine, and up to three cycles in saliva. Moreover, stability study of all analytes over a period of one year revealed that standard solution in methanol stored at 4oC can be used without any remarkable degradation.
περισσότερα
