Ανάπτυξη βιοκαταλυτικών διεργασιών σε μη συμβατικά μέσα για την τροποποίηση ενώσεων φυτικής προέλευσης με στόχο την αναβάθμιση των ιδιοτήτων τους

Abstract

In the present PhD thesis, it was studied the development of biocatalytic process for the modification of main constitutes of mastic oil, with ultimate target the increasement of their biological action. For this purpose, it was investigated the biotransformation of the essential oil and its main constitutes such as α-pinene and d-limonene, with the use of enzymes such as chloroperoxidase from the fungus Caldariomyces fumago (CPO) and laccases from the fungus Trametes versicolor (TvL), Trametes hirsuta (ThL) and Botrytis cinerea (BcL), as well as with the use of hydrolytic enzymes such as lipase B from Candida antarctica (CaLB), in non conventional media. These enzymes were used either in free form or immobilized on solid supports. The enzymatic biotransformation of the hydrophobics monoterepenes were examined in non conventional media with low water content (microemulsions, ternary systems, organic media) which are formed with main constitutes of mastic oil (α-pinene, d-limonene). With the aim to maximize the catalytic performance of chloroperoxidase from Caldariomyces fumago (CPO) in surfactant free ternary systems, the influence of the composition and the hydration state of the system, the nature of the oxidizing agent as well as substrate availability on the catalytic behavior and stability of the enzyme was investigated, using the chlorination of monochlorodimedone (MCD) and the epoxidation of styrene as model reactions. It was concluded that in low water systems formulated with α-pinene CPO stability is significantly increased compared to other reaction media (up to 65% residual activity after 24 h of incubation at 30°C). The increased stability was in accordance with differential scanning calorimetry (DSC) findings. Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy indicated that in low water content systems the ferric environment of the active site of CPO does not undergo severe modifications. The kinetic analysis in all cases followed the Michaelis-Menten kinetic and the results revealed that the catalytic efficiency of CPO strongly depended on the composition and the water content of ternary systems. Notable is the accomplishment of the enzymatic oxidation of various olefins and terpenols (geraniol, nerol, perillyl alcohol) catalyzed by CPO in various ternary systems. Total turnover numbers (TTN) obtained for the oxidation of terpenols in α-pinene-based systems, were up to 25,000 which is 2-170 times higher than previously reported values. Τhe enzymes TvL, ThL, BcL exhibited improved catalytic efficiency (5 to 10-fold) in α-pinene-rich environment, while optimal reaction rates were observed in high-water content systems (15.5% v/v). Also the kinetic study, which was based on laccase-catalyzed oxidation of ABTS, revealed that the kinetic constants of the enzymes are strongly affected by the composition of the ternary systems. Moreover laccases stability significantly improved in monoterpene-based systems (up to 90% residual enzyme activity after 24 hours at 30°C) in comparison with other non conventional media. Finally, the enzymatic modification of the terpenes (α-pinene, d-limonene) and of the mastic oil, which is catalyzed by free or immobilized laccases, depends from the nature and the concentration of the mediator. Also in the present study the modification of the main constitutes of mastic oil was studied through their chemoenzymatic oxidation with the use of immobilized lipase. For this reason it was investigated the immobilization of the lipase CaLB onto nanoclays (parent or organic-modified clays). The resulting hybrid biocatalysts were characterized by a combination of powder X-ray diffraction (XRD), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), thermogravimetric and differential thermal analysis (ΤGA/DTA) infrared spectroscopy (FTIR) and scanning electron spectroscopy (SEM). Structural and biochemical characterization of immobilized lipase revealed that the microenvironment created by the organically modified clays induces beneficial changes on the structure and biocatalytic behaviour resulting in enhanced thermal stability (75% after incubation for 24 hours in nhexane at 60°C). Moreover from the FT-IR spectroscopy in the Amide I region, it was concluded that the seconday structure of the enzyme upon immobilization into parent or organomodified clays changed. With the use of the immobilized lipase it was successfully achieved the chemoenzymatic epoxidation of mastic oil, α-pinene and d-limonene. The production yield of the epoxide is strongly affected by the carrier, the nature and the concentration of the oxidizing agent as well as from the polarity of the organic solvent. The enzyme retains up to 90% of its initial activity, even after 48 hours of incubation in the presence of oxidant (H₂O₂) and up to 60% after four reaction cycles (96 hours of total reaction time at 50°C). Generally the activity and stability of immobilized CaLB in this biocatalytic process is of the highest that have been mentioned in the literature. By inference, both oxidoreductase (CPO, TvL, ThL, BcL) and hydrolase (CaLB) enzymes can be efficiently employed in non toxic systems, which are composed by the basic components of mastic oil, for the development of bioconversions, which main target is the modification of terpenes into oxygenated products (verbenol, verbenone) with increased biological action.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η δυνατότητα ανάπτυξης βιοκαταλυτικών διεργασιών για την τροποποίηση των βασικών συστατικών του μαστιχελαίου με στόχο την αύξηση της βιολογικής τους δράσης. Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκε η δυνατότητα βιομετατροπής τόσο του αιθέριου ελαίου όσο και των βασικών συστατικών του όπως π.χ. του α-πινενίου και του d-λιμονενίου, με τη χρήση απομονωμένων ενζύμων όπως η χλωροϋπεροξειδάση από τον μύκητα Caldariomyces fumago (CPO) και οι λακκάσες από τους μύκητες Trametes versicolor (TvL), Trametes hirsuta (ThL) και Botrytis cinerea (BcL), αλλά και υδρολυτικών ενζύμων όπως η λιπάση Β από Candida antarctica (CaLB), σε μη συμβατικά συστήματα. Τα ένζυμα αυτά χρησιμοποιήθηκαν είτε σε ελεύθερη μορφή (ως υδατικά διαλύματα) είτε ως ακινητοποιημένα ενζυμικά σκευάσματα. Η ενζυμικά καταλυόμενη τροποποίηση των υδρόφοβων μονοτερπενίων εξετάστηκε σε μη συμβατικά συστήματα χαμηλής περιεκτικότητας σε νερό (μικρογαλακτώματα, τριαδικά συστήματα, οργανικά μέσα) που σχηματίζονται με βάση τα κύρια συστατικά του μαστιχελαίου (α-πινένιο, d-λιμονένιο). Με στόχο τη μελέτη των καταλυτικών ιδιοτήτων της CPO σε μικρογαλακτώματα, η επίδραση της σύστασης και του βαθμού ενυδάτωσης του συστήματος, της φύσης του οξειδωτικού φορέα καθώς επίσης και η διαθεσιμότητα του υποστρώματος μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ως πρότυπες αντιδράσεις τη χλωρίωση της μονοχλωροδιμεδόνης (MCD) και την εποξείδωση του στυρενίου. Διαπιστώθηκε ότι στα συστήματα με βάση το α-πινένιο τα οποία έχουν χαμηλή περιεκτικότητα σε νερό, η σταθερότητα της CPO είναι σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με άλλα μέσα (μέχρι και 65% εναπομένουσα δραστικότητα μετά από 24 h επώασης στους 30°C). Η αυξημένη σταθερότητα της CPO επιβεβαιώθηκε και από τα αποτελέσματα της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης DSC. Η μελέτη με τη χρήση του ηλεκτρονικού παραμαγνητικού συντονισμού, (EPR) έδειξε ότι στα συστήματα με χαμηλή περιεκτικότητα σε νερό το μικροπεριβάλλον του σιδήρου της αίμης του ενεργού κέντρου του ενζύμου δεν υφίσταται σοβαρές τροποποιήσεις. Η κινητική ανάλυση έδειξε ότι σε όλες τις περιπτώσεις ακολουθείται η κινητική Michaelis-Menten και ότι οι κινητικές σταθερές της CPO εξαρτώνται ισχυρά από τη σύσταση του τριαδικού συστήματος και ιδιαίτερα από την περιεκτικότητά του σε νερό. Αξιοσημείωτη είναι η επίτευξη ενζυμικά καταλυόμενων αντιδράσεων οξείδωσης τόσο ολεφινών όσο και τερπενολών (γερανιόλης, νερόλης και περιλλύλ-αλκοόλης) που καταλύονται από τη CPO σε διάφορα τριαδικά συστήματα. Ο ολικός αριθμός μετατροπής (TTN) που προσδιορίστηκε κατά την οξείδωση διαφόρων ολεφινών και τερπενολών σε τριαδικά συστήματα με βάση το α-πινένιο, είχε τιμές μέχρι και 25000, οι οποίες είναι 2-170 φορές υψηλότερες από αυτές που έχουν μέχρι τώρα δημοσιευτεί. Τα ένζυμα TvL, ThL, BcL επέδειξαν βελτιωμένη καταλυτική δραστικότητα (5 έως 10 φορές) σε μέσα πλούσια σε α-πινένιο, ενώ παράλληλα βέλτιστες ταχύτητες οξείδωσης παρατηρήθηκαν σε συστήματα με υψηλή περιεκτικότητα σε νερό (15.5% v/v). Επίσης από την κινητική μελέτη της οξείδωσης του ABTS που καταλύεται από τις λακκάσες διαπιστώθηκε ότι οι κινητικές σταθερές των ενζύμων εξαρτώνται από τη σύσταση του τριαδικού συστήματος. Επιπλέον η σταθερότητα των λακκασών ήταν αυξημένη σε τριαδικά συστήματα που σχηματίζονται με βάση τα μονοτερπένια α-πινένιο ή d-λιμονένιο (μέχρι και 90% εναπομένουσα δραστικότητα μετά από 24h επώασης στους 30°C) σε σύγκριση με άλλα μη συμβατικά συστήματα. Διαπιστώθηκε ότι η ενζυμική τροποποίηση τόσο των τερπενίων (α-πινενίου, d-λιμονενίου) όσο και του ιδίου του μαστιχελαίου που καταλύεται τόσο από ελεύθερες όσο και ακινητοποιημένες λακκάσες εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη φύση και τη συγκέντρωση των διαμεσολαβητών. Στην εργασία μελετήθηκε η τροποποίηση των συστατικών του μαστιχελαίου μέσω της χημειο-ενζυμικής οξείδωσής τους με τη χρήση ακινητοποιημένης λιπάσης. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε η δυνατότητα ακινητοποίησης της λιπάσης CaLB σε φυλλόμορφους αργίλους (απλούς και οργανοτροποποιημένους). Οι υβριδικοί βιοκαταλύτες χαρακτηρίστηκαν από μια σειρά τεχνικών όπως περίθλαση ακτίνων-Χ (XRD), φωτοηλεκτρονική φασματοσκοπία ακτίνων-Χ (XPS), θερμική ανάλυση (ΤGA/DTA), φασματοσκοπία μέσω υπερύθρου (FTIR) και με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM). Ο δομικός και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της ακινητοποιημένης λιπάσης αποκάλυψε ότι το μικροπεριβάλλον που δημιουργείται στους οργανικά τροποποιημένους αργίλους, δημιουργεί ευνοϊκές αλλαγές στην δομή και στην βιοκαταλυτική συμπεριφορά του ενζύμου, οδηγώντας σε αυξημένη θερμική σταθερότητα (75% μετά από 24h επώασης σε εξάνιο στους 60°C). Επιπλέον από την ανάλυση του υπερύθρου φάσματος με μετασχηματισμό κατά (FT-IR) στην περιοχή Amide I, διαπιστώθηκε ότι η δευτεροταγής δομής του ενζύμου αλλάζει μετά την ακινητοποίηση του ανάλογα με τον φορέα ακινητοποίησης. Επίσης με την χρήση της ακινητοποιημένης λιπάσης επιτεύχθηκε τόσο η μετατροπή του μαστιχελαίου όσο και του α-πινενίου ή του d-λιμονενίου, στα αντίστοιχα εποξείδια. Η απόδοση του παραγόμενου εποξειδίου επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από το φορέα ακινητοποίησης, τη φύση και τη συγκέντρωση του οξειδωτικού φορέα καθώς επίσης και από την πολικότητα του οργανικού διαλύτη. Ακόμη η ακινητοποιημένη CaLB διατήρησε μέχρι και το 90% της αρχικής της δραστικότητας, ακόμη και μετά από 48h επώασης παρουσία του οξειδωτικού παράγοντα (H₂O₂) καθώς και μέχρι 60% μετά από τέσσερις κύκλους αντίδρασης (96h συνολικής αντίδρασης στους 50°C). Γενικά η δραστικότητα και η σταθερότητα της λιπάσης σε αυτή τη βιοκαταλυτική διεργασία είναι από τις υψηλότερες που έχουν αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία. Συμπερασματικά τόσα τα οξειδοαναγωγικά (CPO, TvL, ThL, BcL) όσο και τα υδρολυτικά (CaLB) ένζυμα είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν αποτελεσματικά σε μη τοξικά συστήματα αποτελούμενα από τα βασικά συστατικά του μαστιχελαίου για την ανάπτυξη βιοδιεργασιών που θα στοχεύουν στην τροποποίηση τους και την παρασκευή παραγώγων (βερμπενόλη, βερμπενόνη) με αυξημένη βιολογική δράση.