Ενζυμική τροποποίηση συστατικών της μαστίχας και του μαστιχέλαιου

Abstract

In the current dissertation, the biotechnological modification of perillyl alcohol, which is a compound of the essential oil of Chios mastic gum, was studied. For the biotransformations of the specific substance biocatalytical methods were developed. These methods were based on the use of hydrolytic enzymes like glucosidases and lipases in non conventional media such as organic solvents, biphasic and solvent free systems. The volatile compound which was chosen to be used in the current dissertation was perillyl alcohol since after a series of studies it is considered to have a significant anticarcinogenic activity. Perillyl alcohol is a primary monoterpenol which is produced as a hydroxylated metabolite of D-limonene in the secondary metabolism of several plant species. By means of biocatalytical processes in non conventional media the selective transformation of perillyl alcohol was carried out. The enzymatic modifications which were carried out to the molecule of perillyl alcohol led to the synthesis of new analogues with altered physicochemical properties. More specifically the synthesis of an analogue with increased polarity such as perillyl β-D-glucopyranoside was carried out through selective glucosylation. Moreover, the further modification of the glucoside which was achieved through enzymatic acylation with a saturated fatty acid led to the synthesis of an amphiphilic molecule. During this study the esterification of perillyl alcohol with several dicarboxylic acids as well as its further linking with D-(+)-glucose molecule were carried out. In order to optimize the procedure of the synthesis of the new analogues, the influence of several reaction parameters was studied. Concerning the synthesis of the esters of perillyl alcohol with dicarboxylic acids, the optimization of the method was carried out using a Response Surface Methodology prediction model. All the new analogues of perillyl alcohol which were synthesized during this dissertation were identified by analyzing the corresponding NMR and LC-MS/MS spectra. Furthermore, there was an attempt to investigate the influence of these modifications in the biological activity in comparison with the native molecule. Those preliminary tests included the influence of the modified molecules in the cell proliferation of Lewis lung carcinoma (LLC) cells and the influence on the chymotrypsin-like activity of the 20S complex of the proteasome on embryonic human lung fibroblasts (HFL-1)

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η βιοτεχνολογική τροποποίηση της περιλλυλ-αλκοόλης που αποτελεί συστατικό του αιθέριου ελαίου της μαστίχας Χίου. Για τη βιομετατροπή του συγκεκριμένου συστατικού αναπτύχθηκαν βιοκαταλυτικές μέθοδοι που βασίστηκαν στη χρήση υδρολυτικών ενζύμων, όπως οι γλυκοζιδάσες και οι λιπάσες, σε μη συμβατικά μέσα, όπως οργανικοί διαλύτες, διφασικά συστήματα και συστήματα «ελεύθερα διαλύτη». Το αρωματικό συστατικό το οποίο επιλέχθηκε να χρησιμοποιηθεί στην παρούσα εργασία ήταν η περιλλυλ-αλκοόλη, αφού από διάφορες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί θεωρείται πως έχει σημαντική αντικαρκινική δράση. Η περιλλυλ-αλκοόλη είναι μία πρωτοταγής μονοτερπενόλη. Με τη χρήση βιοκαταλυτικών μεθόδων σε μη συμβατικά μέσα επιτεύχθηκε η εκλεκτική τροποποίηση της περιλλυλ-αλκοόλης. Οι ενζυμικές τροποποιήσεις που επιχειρήθηκαν στο μόριο της περιλλυλ-αλκοόλης, οδήγησαν στη σύνθεση νέων ενώσεων με τροποποιημένες φυσικοχημικές ιδιότητες. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση ενός αναλόγου με αυξημένη πολικότητα όπως ο περιλλυλ-β-D γλυκοπυρανοζίτης μέσω εκλεκτικής γλυκοζυλίωσης. Ενώ, η περαιτέρω τροποποίηση του γλυκοζίτη που πραγματοποιήθηκε μέσω ενζυμικής ακυλίωσης με ένα κορεσμένο λιπαρό οξύ οδήγησε στη σύνθεση ενός αμφίφιλου μορίου. Στα πλαίσια της σύνθεσης νέων αναλόγων της περιλλυλ-αλκοόλης, επιχειρήθηκε η εστεροποίησή της με διάφορα δικαρβοξυλικά οξέα καθώς και η περαιτέρω σύζευξή της με ένα μόριο D-(+)-γλυκόζης. Με σκοπό τη βελτιστοποίηση των μεθόδων σύνθεσης των νέων αναλόγων, πραγματοποιήθηκε μελέτη των διάφορων παραμέτρων που επηρεάζουν τις ενζυμικές αντιδράσεις. Σε όλα τα νέα ανάλογα της περιλλυλ-αλκοόλης που συντέθηκαν ταυτοποιήθηκε η χημική τους δομή με ανάλυση φασμάτων φασματομετρίας μάζας (LC-MS/MS) παράλληλα με την ανάλυση μονοδιάστατων και δισδιάστατων φασμάτων πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Τέλος, σε όλα τα νέα ανάλογα της περιλλυλ-αλκοόλης που συντέθηκαν στα πλαίσια της διατριβής επιχειρήθηκε μία ενδεικτική μελέτη αναφορικά με την επίδραση των τροποποιήσεων στη βιολογική δράση συγκριτικά με το αρχικό μόριο. Τα προκαταρτικά πειράματα που πραγματοποιήθηκαν αφορούσαν την επίδραση που είχαν η τροποποιήσεις στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων από αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα ποντικιού (LLC), αλλά και στην ενεργότητα τύπου χυμοθρυψίνης του 20S συμπλόκου του πρωτεοσώματος σε κύτταρα από φυσιολογικούς εμβρυϊκούς ανθρώπινους ινοβλάστες πνεύμονα (HFL-1)