Διερεύνηση της ανώμαλης μεθυλίωσης γονιδίων και του στρες του ενδοπλασματικού δικτύου στον καρκίνο του πνεύμονα και μελέτη των μοριακών τους μηχανισμών

Abstract

The present study is divided in two parts. In the first part, aberrant promoter methylation was investigated in a set of selected genes involved in early stages of lung cancer. Methylation signature analysis was performed in DNA from sputum of lung cancer patients, using Methylation specific PCR (MS-PCR) and melting curve analysis. However, the low detection rate of methylation in the particular samples led to the study of alternative molecular mechanisms involved in lung carcinogenesis, such as ER stress. ERp29 is an endoplasmic reticulum (ER) luminal protein with a putative secretion factor/escort chaperone function. Accumulated evidence has implicated ERp29 in the thyroglobulin secretion, polyoma virus transport and recently in carcinogenesis. ERp29 levels were elevated in the tumors of various origins and under the conditions of genotoxic stress, such as ionizing radiation. In this study we report the induction of ERp29 during the treatment of lung cancer cells with doxorubicin, a commonly used antineoplastic agent. Experiments in the p53-/- cells and p53 knockout mouse model revealed that doxorubicin effect on ERp29 is p53 dependent. The increase of ERp29 level appears to activate a negative feedback loop where the elevated amounts of ERp29 augment cell viability of cancer cells after doxorubicin treatment as shown by a clonogenic cell survival assay. To elucidate the mechanisms behind the doxorubicin effects we have studied the impact of ERp29 on the interaction with the ER stress-activated eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3 (PERK) that was shown to facilitate tumor cells resistance to drug toxicity. Co-immunoprecipitation demonstrated physical interaction of ERp29 with PERK and moreover overexpression of ERp29 enhanced endogenous levels of PERK. Our results identify ERp29 as a novel regulator of PERK and provide evidence for the role of ER resident factors in the regulation of chemotherapeutic efficacy. These findings show that PERK may represent a nodal point between ER stress and chemotherapeutic response. In the present study, we also investigated if ERp29 and ER stress are involved in non cell-autonomous interaction mechanisms between cancer cells and fibroblasts in the tumor stroma. Our results suggest that pharmacologic induction of ER stress triggered by tunicamycin in cancer cells leads to paracrine stimulation of fibroblasts’ proliferation and that p21 plays a central role in this effect. SenexinA, a small molecule inhibitor of p21 was used for the pharmacologic inhibition of p21-related transcriptional activity, in vitro and in vivo. In the present study we showed that doxorubicin treatment of normal fibroblasts enhances the proliferation of cancer cells, and this mitogenic activity is reduced by pharmacological inhibition of a p21-related function, is detectable in the systemic circulation, persists after the cytotoxic effects of chemotherapy and generates a cellular environment that favors tumor growth.

Η παρούσα μελέτη αποτελείται από δυο μέρη. Το πρώτο μέρος εστιάζεται στην ανίχνευση της ανώμαλης μεθυλίωσης του υποκινητή επιλεγμένων γονίδιων που εμπλέκονται στον πρώιμο σχηματισμό του καρκίνου του πνεύμονα. Η επικράτηση της μεθυλίωσης των γονίδιων αυτών στη συγκεκριμένη μελέτη εξετάστηκε στο DNA προκλητών πτυέλων ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα χρησιμοποιώντας την ειδική για τη μεθυλίωση PCR (methylation specific PCR MS-PCR) και την ανάλυση σημείου τήξεως του DNA (Tm). Ωστόσο, η ανίχνευση σε μειωμένα ποσοστά μεθυλιώσεων στα υπό μελέτη δείγματα οδήγησε στην προσπάθεια διερεύνησης άλλου τύπου μοριακών αλλοιώσεων που πιθανά σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα. Το δεύτερο μέρος εστιάζεται στη μελέτη της πρωτεΐνης ERp29, μιας πρωτεΐνης του αυλού του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ) με πιθανή δράση εκκριτικού παράγοντα μοριακού συνοδού. Πειραματικά αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ERp29 εμπλέκεται στη έκκριση της θυρεοσφαιρίνης, στη μεταφορά του ιού του πολυώματος και μόλις πρόσφατα στην καρκινογένεση. Στα πλαίσια της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε ο ρόλος της ERp29 στην καρκινογένεση και συγκεκριμένα στην αντικαρκινική θεραπεία. Πειράματα in vitro έδειξαν ότι η ERp29 επάγεται κατά την χορήγηση του αντικαρκινικού φάρμακου αδριαμυκίνη σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. Περεταίρω μελέτες σε κυτταρικές καλλιέργειες καθώς και in vivo σε πειραματόζωα, αποκάλυψαν ότι η επίδραση αυτή της αδριαμυκίνης στην ERp29 εξαρτάται από την πρωτεΐνη p53. Η επαγωγή της ERp29 φαίνεται ότι ενεργοποιεί ένα βρόγχο αρνητικής επανατροφοδότησης όπου τα αυξημένα επίπεδα της ERp29 επάγουν την βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων μετά την επίδραση της χημειοθεραπείας. Για τη διερεύνηση των σχετικών μηχανισμών μελετήθηκε η πιθανή αλληλεπίδραση ERp29 της με τον αισθητήρα του στρες του ΕΔ, τον υποδοχέα PERK, ο οποίος έχει αποδειχτεί ότι συμμετέχει στην αντίσταση των καρκινικών κυττάρων κατά της χημειοθεραπείας. Τα αποτελέσματα της διατριβής επιβεβαιώνουν τη φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ ERp29 και PERK, καθώς και την εξαρτώμενη από το PERK ρύθμιση της βιωσιμότητας των κυττάρων από την ERp29 κατά τη χημειοθεραπεία. Συμπερασματικά, η πρωτεΐνη ERp29 αναγνωρίστηκε ως ένας νέος ρυθμιστής του PERK με δράση που επεκτείνεται και στην ρύθμιση της αποτελεσματικότητας της χημειοθεραπείας. Επιπλέον, ο υποδοχέας PERK μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα κομβικό σημείο μεταξύ του στρες του ενδοπλασματικού δικτύου και της χημικοθεραπευτικής απόκρισης. Παράλληλα, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε και ο ρόλος της ERp29 και του στρες του ενδοπλασματικού δικτύου σε κυτταρικά μη αυτόνομους μηχανισμούς επικοινωνίας μεταξύ καρκινικών κυττάρων και ινοβλαστών στο καρκινικό στρώμα. Τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η φαρμακολογική επαγωγή του στρες του ΕΔ μέσω της τουνικαμυκίνης σε καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε παρακρινική επαγωγή του πολλαπλασιασμού των ινοβλαστών και ότι στο μηχανισμό αυτό πιθανόν εμπλέκεται και η πρωτεΐνη p21. Για τη μελέτη της πιθανής εμπλοκής της p21 χρησιμοποιήθηκε ο φαρμακολογικός αναστολέας της Senexin Α, ο οποίος διευκόλυνε τη μελέτη επίδρασης της p21 τόσο in vitro οσο και in vivo, στις παρακρινικές δράσεις που επάγουν την ανάπτυξη του όγκου και μειώνουν την αποτελεσματικότητα της αντικαρκινικής θεραπείας. Τα αποτελέσματα της διατριβής προτείνουν ότι η επίδραση της αδριαμυκίνης σε φυσιολογικά κύτταρα ενεργοποιεί μια μιτογόνο απόκριση, η οποία καταστέλλεται από τη φαρμακολογική αναστολή της p21, ανιχνεύεται στη συστηματική κυκλοφορία, παραμένει μετά από την επίδραση των κυτταροτοξικών δράσεων της χημειοθεραπείας και δημιουργεί ένα κυτταρικό περιβάλλον που ευνοεί την ανάπτυξη του όγκου.