Κυτταροκίνες ηπατικής ίνωσης σε παιδιά με χρόνια ηπατοπάθεια

Abstract

Hepatic fibrosis develops when there is an imbalance between the cells and the extracellular matrix. Among the TGF-βs cytokines’ superfamily, TGF-β1 has been researched extensively. The latter cytokine plays a role in both the regulation of the proliferation and the differentiation of the cell and the formation or the decomposition of the extracellular matrix. On the other hand, we have not gained any particular understanding as of the possible role of other TGF-β superfamily cytokines in the pathophysiology of chronic hepatitis. Furthermore, it is unknown which of the receptors and the intracellular transducers are causing this development in the liver. The aim of this research study was the investigation of the involvement of TGF-βcytokines superfamily, and especially that of TGF-β1, in liver pathology, and in particular in the generation of cystic fibrosis to children with chronic hepatopathy. The depiction of different type I and type II TGF-β receptors, the role of CTGF and the activation of different protein Smads in patients with chronic hepatopathy, was also addressed. The study dealt with forty-two (42) children with chronic hepatopathy and cystic fibrosis. The extraction of adequate DNA was impossible for nine (9) cases, therefore only thirty three (33) patients were considered for the laboratory tests. Out of those thirty three (33) patients, twelve (12) suffered from cystic fibrosis, ten (10) had steatohepatitis, two (2) were treated for autoimmune hepatitis and five (5) had congenital liver diseases. For the remaining four (4) biopsies showed a healthy liver and thus were used as controls. The study protocol included full laboratory control, liver ultrasound exam and biopsy. Liver biopsy was the ultimate diagnostic tool for patients treated for chronic hepatopathy, whereas liver biopsy was used in the case of cystic fibrosis patients in order to determine the degree of damage and hepatic fibrosis. Histopathological examination of the liver biopsy was subsequently carried out in order to reference in detail the histological damage and the degree of both the inflammation and hepatic fibrosis. Then genetic analysis was performed, mainly RNA extraction, reproduction of a single clone accessory DNA replicate (cDNA), which was then studied with the Real Time PCR method. All cytokines (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, ALK-5, Smad2, 3, 4, 7, and CTGF) were analysed. The results of the study were: There is a strong correlation between the cytokines TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, CTGF and type I receptor (ALK-5) on one hand and fibrosis and inflammation on the other. The same correlation applies to the intracellular transducers Smad2, 3, 4, 7. The study revealed that the cytokines were positively correlated amongst them, with type I receptor (ALK-5) and with intracellular transducers Smad2, 3, 4, 7. The study demonstrates the activation of the TGFs-Smads pathway in hepatic fibrosis. The same results were extracted in the cases of both cystic fibrosis and steatohepatitis. More specifically, with respect to cystic fibrosis, the cytokines were positively correlated amongst them, with type I receptor (ALK-5) and with intracellular transducers Smad 2, 3, 4, 7. Furthermore, in this case, inflammation development was accompanied by fibrosis aggravation. In cystic fibrosis, TGF-β1 and Smad4 to a lesser extent, showed stronger presence in older patients. More specifically TGF-β1 appeared stronger in children aged six (6) and older than in children less than six (6) years old. Transaminases (SGOT, SGPT) showed greater numbers in older cases.

Η ηπατική ίνωση δημιουργείται όταν διαταραχθεί η ισορροπία μεταξύ των κυττάρων και της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και επάγεται μέσω της έκκρισης κυτταροκινών. Από τις κυτταροκίνες της υπεροικογένειας TGF-βs, έχει μελετηθεί ιδιαίτερα ο TGF-β1. Από την άλλη δεν υπάρχει καμία γνώση για τον πιθανό ρόλο των άλλων κυτταροκινών της υπεροικογένειας των TGF-βs στην παθοφυσιολογία της χρόνιας ηπατίτιδας και στην επακόλουθη ανάπτυξη ίνωσης στον άνθρωπο. Επιπρόσθετα, δεν είναι γνωστό ποιοι από τους υποδοχείς και τους ενδοκυττάριους διαμεσολαβητές, ενοχοποιούνται σε αυτή τη διαδικασία στο ήπαρ. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση της συμμετοχής των κυτταροκινών της υπεροικογένειας TGF-β1 στην παθολογία του ήπατος και ειδικότερα της συμμετοχής του TGF-β1 καθώς και των κυτταροκινών της υπεροικογένειας του TGF-βs στη διαδικασία της ηπατικής ίνωσης σε παιδιά με χρόνια ηπατοπάθεια. Επίσης αναλύθηκε η έκφραση διαφορετικών υποδοχέων τύπου Ι και τύπου ΙΙ των TGF-βs, ο ρόλος του CTGF καθώς και η ενεργοποίηση διαφορετικών πρωτεϊνών Smads σε ασθενείς με χρόνια ηπατοπάθεια. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 42 παιδιά με χρόνια ηπατοπάθεια και Κυστική Ίνωση. Από τους παραπάνω ασθενείς συμπεριλήφθησαν στο εργαστηριακό μέρος της μελέτης οι 33 ασθενείς, λόγω της αδυναμίας εξαγωγής ικανοποιητικού DNA από τον ηπατικό ιστό από τους υπόλοιπους 9 (εννέα). Από τους 33 ασθενείς οι 12 ήταν ασθενείς με Κυστική Ίνωση, οι 10 με Στεατοηπατίτιδα, οι 2 με Αυτοάνοση Ηπατίτιδα και 5 με συγγενή νοσήματα του ήπατος. Οι υπόλοιποι 4 είχαν φυσιολογική βιοψία ήπατος και χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Το πρωτόκολλο της μελέτης περιελάμβανε πλήρη εργαστηριακό έλεγχο, υπερηχογράφημα ήπατος και βιοψία ήπατος. Η βιοψία ήπατος αποτέλεσε το τελευταίο διαγνωστικό μέσο σε ασθενείς με χρόνια ηπατοπάθεια ενώ σε ασθενείς με Κυστική Ίνωση η βιοψία πραγματοποιήθηκε για να αναδειχθεί ο βαθμός βλάβης και ίνωσης του ήπατος. Ακολούθησε η ιστοπαθολογική εξέταση του δείγματος. Ακολούθησε γενετικός έλεγχος, που περιελάμβανε απομόνωση RNA, παραγωγή ενός μονόκλωνου συμπληρωματικού αντιγράφου του DNA (cDNA) από το RNA και επεξεργασία του cDNA με τη μέθοδο Real Time PCR. Αναλύθηκαν όλες οι κυτταροκίνες TGFs (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3), CTGF, οι ενδοκυττάριοι διαμεσολαβητές Smads και ο υποδοχέας τύπου Ι ALK-5. Τα αποτελέσματα της μελέτης συνοψίζονται ως εξής: παρατηρήθηκε ισχυρή συσχέτιση των κυτταροκινών της μελέτης (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, CTGF) καθώς και του υποδοχέα τύπου Ι (ALK-5) με την ίνωση και τη φλεγμονή. Το ίδιο παρατηρήθηκε και με τους ενδοκυττάριους διαμεσολαβητές Smad2, Smad3, Smad4 και Smad7. Επίσης στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση των κυτταροκινών μεταξύ τους, με τον υποδοχέα τύπου Ι (ALK-5) καθώς και με τους ενδοκυττάριους μεσολαβητές (Smad2, Smad3, Smad4 και Smad7). Αποδεικνύεται λοιπόν η ενεργοποίηση της οδού των κυτταροκινών TGF-βs-Smads στην ηπατική ίνωση. Τα αποτελέσματα αυτά διαπιστώθηκαν τόσο στην Κυστική Ίνωση όσο και στη Στεατοηπατίτιδα. Συγκεκριμένα στην Κυστική Ίνωση διαπιστώθηκε ισχυρή συσχέτιση των κυτταροκινών της μελέτης, των Smads και του υποδοχέα τύπου Ι (ALK-5). Παρατηρήθηκε λοιπόν ενεργοποίηση της οδού των κυτταροκινών TGFs-Smads. Επιπρόσθετα διαπιστώθηκε και στην Κυστική Ίνωση, ότι παράλληλα με την εξέλιξη της φλεγμονής παρατηρήθηκε και αύξηση της ίνωσης. Ακόμη στην Κυστική Ίνωση παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του TGF-β1 και σε μικρότερο βαθμό του Smad4 σε σχέση με την ηλικία. Συγκεκριμένα παρατηρείται μεγαλύτερη έκφραση του TGF-β1 σε παιδιά >6 ετών σε σχέση με αυτά <6 ετών. Επίσης παρατηρήθηκε αύξηση των τρανσαμινασών (SGOT, SGPT) σε σχέση με την αύξηση της ηλικίας, δηλαδή σε πιο μεγάλες ηλικίες στην Κυστική Ίνωση υπήρχε αύξηση των τρανσαμινασών.