Περίληψη
Η απομόνωση εμβρυϊκών κυττάρων από το περιφερικό αίμα της εγκύου κατά τη διάρκεια της κύησης δίνει νέες δυνατότητες ανάπτυξης αξιόπιστων και ασφαλών μεθόδων μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν από όλες τις εγκύους, ανεξαρτήτως ηλικίας ή αντικειμενικού κινδύνου που έχουν να αποκτήσουν παιδί με χρωμοσωμική ανωμαλία. Από τους διάφορους τύπους των εμβρυϊκών κυττάρων που μπορούν να ανιχνευτούν στη μητρική κυκλοφορία, τα εμβρυϊκά εμπύρηνα ερυθρά κύτταρα (NRBCs) θεωρούνται τα πλέον κατάλληλα, γιατί αφθονούν στο εμβρυϊκό αίμα κατά το 1ο τρίμηνο, είναι μονοπύρηνα, έχουν πλήρη χρωμοσωμική σύσταση, χαρακτηριστική μορφολογία και μικρό χρόνο ζωής. ΄Ομως, η σπανιότητα των εμβρυϊκών NRBCs στο περιφερικό αίμα της εγκύου και η έλλειψη πολύ ειδικών δεικτών που να τα ξεχωρίζουν από τα μητρικά που τα περιβάλλουν, παρεμποδίζουν προς το παρόν τουλάχιστον τη χρησιμοποίησή τους στην κλινική πράξη.
Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η βελτίωση και προτύπωση με ...
Η απομόνωση εμβρυϊκών κυττάρων από το περιφερικό αίμα της εγκύου κατά τη διάρκεια της κύησης δίνει νέες δυνατότητες ανάπτυξης αξιόπιστων και ασφαλών μεθόδων μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν από όλες τις εγκύους, ανεξαρτήτως ηλικίας ή αντικειμενικού κινδύνου που έχουν να αποκτήσουν παιδί με χρωμοσωμική ανωμαλία. Από τους διάφορους τύπους των εμβρυϊκών κυττάρων που μπορούν να ανιχνευτούν στη μητρική κυκλοφορία, τα εμβρυϊκά εμπύρηνα ερυθρά κύτταρα (NRBCs) θεωρούνται τα πλέον κατάλληλα, γιατί αφθονούν στο εμβρυϊκό αίμα κατά το 1ο τρίμηνο, είναι μονοπύρηνα, έχουν πλήρη χρωμοσωμική σύσταση, χαρακτηριστική μορφολογία και μικρό χρόνο ζωής. ΄Ομως, η σπανιότητα των εμβρυϊκών NRBCs στο περιφερικό αίμα της εγκύου και η έλλειψη πολύ ειδικών δεικτών που να τα ξεχωρίζουν από τα μητρικά που τα περιβάλλουν, παρεμποδίζουν προς το παρόν τουλάχιστον τη χρησιμοποίησή τους στην κλινική πράξη.
Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η βελτίωση και προτύπωση μεθόδου μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου από εμβρυϊκά NRBCs που απομονώνονται από το περιφερικό αίμα της εγκύου.
Για το λόγο αυτό:
1. Αξιολογήθηκαν διαφορετικοί τρόποι εμπλουτισμού του περιφερικού αίματος της εγκύου σε NRBCs και δύο μονοκλωνικά αντισώματα που αναγνωρίζουν τον υποδοχέα της τρανσφερίνης σε διάφορους συνδυασμούς, ώστε να βρεθεί ο συνδυασμός εκείνος με τον οποίο απομονώνεται ο μεγαλύτερος αριθμός εμβρυϊκών NRBCs, ενώ ταυτόχρονα ελαττώνονται οι μητρικές προσμίξεις.
2. Εκτιμήθηκε η δυνατότητα προγεννητικής διάγνωσης χρωμοσωμικών ανωμαλιών του εμβρύου από εμβρυϊκά NRBCs που απομονώνονται από το περιφερικό αίμα της εγκύου.
Μελετήθηκαν συνολικά 568 δείγματα περιφερικού αίματος εγκύων στο 2ο τρίμηνο της κύησης (20ml σε EDTA): 513 δείγματα προήλθαν από εγκύους που κυοφορούσαν έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία, 26 δείγματα από εγκύους που κυοφορούσαν έμβρυα με χρωμοσωμικές ανωμαλίες (τρισωμία 21: n=18, τρισωμία 18: n=2, τρισωμία 13: n=1, μωσαϊκό τρισωμίας 12: n=1, 47,ΧΧΧ: n=1, 45,XO: n=3) και 29 δείγματα ελήφθησαν από εγκύους φορείς β - μεσογειακής αναιμίας που κυοφορούσαν έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία.
Ο εμπλουτισμός του περιφερικού αίματος της εγκύου σε NRBCs έγινε με φυγοκέντρηση βαθμιδωτής πυκνότητας με Histopaque 1083gr/ml και μαγνητικό διαχωρισμό MACS με τη χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων για τον υποδοχέα της τρανσφερίνης, άμεσα και έμμεσα σημασμένων με μαγνητικά σφαιρίδια, τα οποία αναγνωρίζουν διαφορετικούς επιτόπους του υποδοχέα. Τα NRBCs που απομονώθηκαν από τη μητρική κυκλοφορία, ταυτοποιήθηκαν με μορφολογικά κριτήρια σε οπτικό μικροσκόπιο μετά από αιματολογική χρώση May - Grunwald/Giemsa.
190 δείγματα που ελήφθησαν από εγκύους που κυοφορούσαν έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία χρησιμοποιήθηκαν για την προτύπωση της μεθόδου. Έγινε σύγκριση της δυνατότητας απομόνωσης NRBCs από το περιφερικό αίμα της εγκύου με συνδυασμό αρνητικής και θετικής επιλογής σε σχέση με τη θετική επιλογή. Ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε μετά από θετική επιλογή ήταν μεγαλύτερος από αυτόν που απομονώθηκε μετά από το συνδυασμό αρνητικής και θετικής επιλογής (7 έναντι 6). Για το λόγο αυτό, στα υπόλοιπα δείγματα η απομόνωση των NRBCs έγινε μόνο με θετική επιλογή.
Στη συνέχεια, συγκρίθηκαν τα δύο μονοκλωνικά αντισώματα για τον υποδοχέα της τρανσφερίνης, το εμπορικά διαθέσιμο CD71 και το 2F6.3, τόσο σε σημασμένη όσο και σε μη σημασμένη μορφή. Διαπιστώθηκε ότι ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε με το εμπορικά διαθέσιμο CD71 ήταν 6.52 (εύρος 2 – 26) έναντι 4.04 (εύρος 2 – 14) με το μη σημασμένο 2F6.3, καθώς επίσης ότι ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε με το εμπορικά διαθέσιμο CD71 ήταν 7.04 (εύρος 2 – 28) έναντι 5.96 (εύρος 2 – 20) με το σημασμένο με μαγνητικά σφαιρίδια 2F6.3, γι’ αυτό το εμπορικά διαθέσιμο CD71 χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για απομόνωση των NRBCs από τα υπόλοιπα 378 δείγματα.
NRBCs απομονώθηκαν συνολικά σε 475/568 (84%) δείγματα. Σε 416 εγκύους με έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία, ο μέσος αριθμός NRBCs ήταν 7 (εύρος 6.52 – 7.5). Σε 4 περιπτώσεις με φυσιολογικό καρυότυπο, ο μέσος αριθμός NRBCs ήταν 104 (εύρος 77 – 120), πιθανώς λόγω διαταραχής της αιμοποίησης στη μητέρα ή τυχαίας απελευθέρωσης NRBCs τη στιγμή της αιμοληψίας.
Σε 29 εγκύους φορείς β-μεσογειακής αναιμίας που κυοφορούσαν έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία, ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε ήταν 61 (εύρος 22 – 158).
Σε 26 περιπτώσεις με ανευπλοειδή έμβρυα, ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε ήταν 33.5 (εύρος 5 - 113): σε κυήσεις εμβρύων με τρισωμία 21 ήταν 66 (εύρος 22 - 113), στις δύο κυήσεις εμβρύων με τρισωμία 18 ήταν 6 (εύρος 5 - 7) και στην κύηση με έμβρυο με τρισωμία 13 ήταν 37. 8 NRBCs απομονώθηκαν από την κύηση με έμβρυο με μωσαϊκό τρισωμίας 12. Ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε στις τρεις κυήσεις με 45,ΧO έμβρυα ήταν 51 (εύρος 43 - 58) και στην κύηση με 47,XXX έμβρυο ήταν 12.
Η τεχνική FISH εφαρμόστηκε σε 95 δείγματα περιφερικού αίματος εγκύων στα οποία ο αριθμός NRBCs που απομονώθηκε ήταν αρκετά μεγάλος (>5). Σε 70 δείγματα από κυήσεις εμβρύων χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία έγινε ανίχνευση του φύλου του εμβρύου χρησιμοποιώντας ειδικούς ανιχνευτές για τα χρωμοσώματα Χ και Υ και σε 25 δείγματα (7 από κυήσεις υψηλού κινδύνου για τρισωμία 21 και 18 από κυήσεις εμβρύων με τρισωμία 21) έγινε ανίχνευση τόσο του φύλου όσο και της ανευπλοειδίας του εμβρύου, χρησιμοποιώντας ειδικούς ανιχνευτές για τα χρωμοσώματα Χ και 21.
Ο υβριδισμός ήταν επιτυχής σε 70/95 (74%) δείγματα. Το φύλο του εμβρύου καθορίστηκε σωστά σε 67/70 (96%) δείγματα. Η τρισωμία 21 επιβεβαιώθηκε στα 18 δείγματα που προέρχονταν από κυήσεις εμβρύων με τρισωμία 21 και αποκλείστηκε στα 7 δείγματα που προέρχονταν από κυήσεις υψηλού κινδύνου.
Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει τη δυσκολία απομόνωσης και μελέτης των NRBCs με FISH κυρίως λόγω της έλλειψης ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων που να διευκολύνουν την απομόνωσή τους, αλλά και του αποπτωτικού τους χαρακτήρα. Ταυτόχρονα όμως, επιβεβαιώνει ότι τα εμβρυϊκά κύτταρα μπορούν να απομονωθούν κατά τη διάρκεια της κύησης με μαγνητικό διαχωρισμό και να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό του φύλου και της τρισωμίας 21 του εμβρύου, που αποτελεί την πιο κοινή βιώσιμη ανευπλοειδία. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει ο αυξημένος αριθμός των NRBCs στη μητρική κυκλοφορία σε κυήσεις εμβρύων με ορισμένες χρωμοσωμικές ανωμαλίες, ο οποίος θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν επιπλέον δείκτης πληθυσμιακού ελέγχου. Η διαπίστωση όμως αυξημένου αριθμού NRBCs σε εγκύους φορείς β – μεσογειακής αναιμίας που κυοφορούσαν έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία καθώς και σε 1% περίπου κυήσεων εμβρύων χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα αποτελέσματα. Επομένως, η μη επεμβατική τεχνική που μελετήθηκε θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν μια εναλλακτική μέθοδος για την ταυτοποίηση φυσιολογικών και μη εμβρύων, αρκεί η κατάσταση αναιμίας της μητέρας να λαμβάνεται υπόψιν.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Isolation of fetal cells from maternal peripheral blood during pregnancy gives today new possibilities to the development of reliable and safe non - invasive prenatal testing, which can be offered to all women, regardless of their age or risk of having a child with chromosomal abnormality. Nucleated Red Blood Cells (NRBCs) are the fetal cells of choice, since they are abundant in first trimester fetal blood, mononuclear and have a full complement of nuclear genes, a distinctive morphology and limited life span. However, their rarity and the lack of specific markers that distinguish them from the maternal ones, hamper their successful isolation.
The aim of the present study was the improvement and standardization of techniques for a non – invasive prenatal testing from fetal NRBCs isolated from maternal peripheral blood.
1. Different methods of NRBC enrichment from maternal peripheral blood and two monoclonal antibodies to the transferring receptor, in various combinations, were i ...
Isolation of fetal cells from maternal peripheral blood during pregnancy gives today new possibilities to the development of reliable and safe non - invasive prenatal testing, which can be offered to all women, regardless of their age or risk of having a child with chromosomal abnormality. Nucleated Red Blood Cells (NRBCs) are the fetal cells of choice, since they are abundant in first trimester fetal blood, mononuclear and have a full complement of nuclear genes, a distinctive morphology and limited life span. However, their rarity and the lack of specific markers that distinguish them from the maternal ones, hamper their successful isolation.
The aim of the present study was the improvement and standardization of techniques for a non – invasive prenatal testing from fetal NRBCs isolated from maternal peripheral blood.
1. Different methods of NRBC enrichment from maternal peripheral blood and two monoclonal antibodies to the transferring receptor, in various combinations, were investigated in order to determine the combination with which the maximum number of fetal NRBCs is retrieved with minimal maternal cell contamination.
2. Use of fetal NRBCs isolated from maternal blood for non - invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies was evaluated.
Twenty ml of peripheral blood were collected from 568 women in the 2nd trimester of pregnancy: 513 women carried chromosomally normal fetuses, 26 had chromosomally abnormal fetuses (trisomy 21: n=18, trisomy 18: n=2, trisomy 13: n=1, mosaic for trisomy 12: n=1, 47,XXX: n=1 and 45,XO: n=3) and 29 samples were obtained from pregnant women, carriers of β-thalassemia trait, known to carry chromosomally normal fetuses.
For NRBC enrichment, density gradient centrifugation with Histopaque 1083gr/ml was performed, followed by magnetic activated cell sorting (MACS) using two monoclonal antibodies to the transferrin receptor, conjugated and non - conjugated with magnetic beads, which recognize different epitopes of the receptor. Isolated NRBCs were then stained with May-Grunwald/Giemsa and enumerated using morphological criteria by a light microscope.
190 samples coming from women carrying chromosomally normal fetuses were used for the standardization of the method. Isolation of NRBCs from maternal peripheral blood using a combination of negative and positive selection was compared to positive selection only. The average number of isolated NRBCs after positive selection was higher than that isolated after negative and positive selection (7 against 6) and positive selection was used for the isolation of NRBCs from the remaining samples.
Next, the two monoclonal antibodies to the transferring receptor, the commercially available CD71 and 2F6.3 in conjugated and non – conjugated with magnetic beads form were compared. The average number of isolated NRBCs with commercially available CD71 was 6.52 (range 2 – 26) versus 4.04 (range 2 – 14) with non – conjugated 2F6.3. The average number of isolated NRBCs with commercially available CD71 was 7.04 (range 2 – 28) against 5.96 (range 2 – 20) with conjugated 2F6.3. For this reason, commercially available CD71 was used for the isolation of NRBCs from the remaining samples.
NRBCs were detected in 475/568 (84%) of the samples tested. Among 416 women with chromosomally normal fetuses, 7 (range 6.52 – 7.5) NRBCs were identified. In 4 cases with normal karyotype an average of 104 (range 77 – 120) NRBCs were isolated, possibly due to the disruption of haemopoiesis in the mother or the random liberation of NRBCs at the time of sampling.
In 29 pregnant women carriers of β-thalassemia trait with chromosomally normal fetuses, the mean number of isolated NRBCs was 61 (range 22 – 158).
Among 26 women with chromosomally abnormal fetuses, the mean number of isolated NRBCs was 33.5 (range 5 – 113): in 18 cases with a trisomy 21 fetus the mean number was 66 (range 22 – 113), in two pregnancies with a trisomy 18 fetus it was 6 (range 5 – 7) and in one pregnancy with a trisomy 13 fetus it was 37. Eight NRBCs were isolated from the blood of a woman carrying a fetus with mosaic trisomy 12. The average number of isolated NRBCs in 3 pregnancies with a Turner syndrome fetus was 51 (range 43 – 58) and in one woman with a 47,XXX fetus it was 12.
FISH was performed in 95 cases where more than 5 NRBCs were identified. In 70 samples from women with chromosomally normal fetuses, FISH was performed in order to determine the fetal sex using X and Y chromosome specific probes and in 25 samples (7 from high risk pregnancies for trisomy 21 and 18 from pregnancies with a trisomy 21 fetus) FISH was performed for the detection of both fetal sex and aneuploidy using X and 21 chromosome specific probes.
Hybridization was successful in 70/95 (74%) samples. Fetal sex was correctly determined in 67/70 (96%) cases. In all instances with trisomy 21 the aneuploidy was confirmed and in high risk pregnancies it was excluded.
The present study confirms the difficulty of enrichment and FISH analysis on NRBCs isolated from maternal blood due to the lack of specific monoclonal antibodies for their recognition and their apoptotic status. At the same time, it confirms that fetal cells can be isolated from maternal circulation with a magnetic cell sorter and used for the determination of fetal sex and trisomy 21, which is the most common viable fetal aneuploidy. Of significant interest is the increased number of NRBCs in maternal blood in pregnancies with some chromosomal abnormalities which can serve as an additional screening marker for fetal aneuploidies. However, the finding of increased number of NRBCs in women carriers of β-thalassemia trait known to carry chromosomally normal fetuses, as wells as, in almost 1% of pregnancies carrying chromosomally normal embryos could lead to wrong results. Therefore, the above non – invasive technique could be used as an alternative method for identifying the possibility of fetal aneuploidies as long as the anemic status of the mother is taken into consideration.
περισσότερα