Νέες τεχνικές ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων

Abstract

Deoxyribonucleic acid (DNA) is a nucleic acid that contains all the genetic instructions used in the development and functioning of all known living organisms. The DNA molecules that are present within a cell constitute its genetic material. This genetic information does not only serve as the hereditary material but also regulates the specialization of each cell on the realization of its particular operations. DNA also enables genetic variation as a result of various mutational events. Thus DNA is in fact the identity-molecule for each individual and each organism. The present dissertation aims at the development of novel techniques in nucleic acid analysis. The thesis is mainly focused on the development of novel methods for genotyping single nucleotide polymorphisms (SNPs). The methods are rapid, simple, reliable and of low cost. These methods are based: (a) on a dry reagent DNA biosensor, which enables visual detection of allele specific products, without instrumentation, and (b) on bioluminometric assay of allele specific products in microtiter wells. Detection by the DNA biosensor exploits the unique optical properties of gold nanoparticles as reporters whereas the bioluminometric method is based on the photoprotein aequorin that serves as a reporter molecule. These methods are applied in the authentication of coffee species. The photophysical properties of the DNA fluorescent dye SYBR Green I are also studied. SYBR Green I exhibits a large fluorescence enhancement upon binding with DNA. Steady state as well as time-resolved measurements have been made. The time-resolved dynamics were studied using femtosecond time-resolved up-conversion spectroscopy. This technique provides a resolution in the fs regime, allowing the examination of ultrafast phenomena. The theoretical background of this dissertation is outlined in the first six chapters. Chapter 1 describes the structure of DNA and the polymerase chain reaction (PCR), a technique that allows the exponential amplification of DNA. Chapter 2 presents various techniques for the detection of PCR products. Chapter 3 focuses on genotyping methods for single nucleotide polymorphisms. Emphasis is given in the allele discrimination reactions. Chapter 4 describes the role of gold nanoparticles in DNA analysis. The synthetic methods, the optical properties of gold nanoparticles, as well as the functionalization methods of gold surface are presented. In chapter 5, bioluminesence and chemiluminescence are described. The usual chemiluminescent and bioluminescent probes, as well as their applications in DNA analysis are discussed. In Chapter 6 the ultrafast fluorescence dynamics are discussed. Description of the femtosecond time-resolved up-conversion spectroscopy, the femtosecond laser and the experimental set up, are reported. The experimental part of this dissertation consists of four chapters. Instrumentation and reagents that were used during the experimental work are described in Chapter 7. Chapter 8 focuses on the development of a novel method for visual genotyping of SNPs by primer extension reaction (PEXT) coupled with a dry-reagent DNA biosensor. In contrary to other genotyping methods, the proposed method allows visual detection of the PEXT products, within a few minutes, without any instrumentation. The objective of Chapter 9 is the development of a rapid and low-cost method for the quantitative determination of coffee species. This method combines a PEXT reaction with a bioluminometric hybridization assay. The photoprotein aequorin is used as a reporter molecule. In Chapter 10 the photophysical properties of SYBR Green I in free form and bound to single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and triple-stranded DNA (tsDNA) are studied. Steady state as well as time-resolved measurements are presented. The fluorescence decay is studied, for the first time, in the fs to ps scale.

Το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) είναι ένα νουκλεϊκό οξύ που περιέχει τις γενετικές πληροφορίες που καθορίζουν τη βιολογική ανάπτυξη και λειτουργία όλων των γνωστών ζωντανών οργανισμών. Το σύνολο των μορίων DNA που υπάρχουν σε ένα κύτταρο αποτελούν το γενετικό υλικό του. To DNA είναι ο φορέας των γενετικών πληροφοριών του κυττάρου, όχι μόνον με την έννοια της μεταβίβασης χαρακτηριστικών, αναλλοίωτων από γενιά σε γενιά, αλλά και της ρύθμισης της φυσιογνωμίας εξειδίκευσης κάθε κυττάρου για την επιτέλεση των ιδιαίτερων λειτουργιών του. Επίσης, το DNA επιτρέπει τη δημιουργία γενετικής ποικιλότητας, υφιστάμενο μεταλλάξεις. Έτσι το DNA είναι ουσιαστικά το μόριο-ταυτότητα για κάθε άτομο και κάθε οργανισμό. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη νέων τεχνικών ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων. To μεγαλύτερο μέρος της διατριβής αφορά την ανάπτυξη νέων µεθόδων γονοτύπησης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών (SNP), οι οποίες είναι ιδιαίτερα απλές στην εκτέλεση, έχουν χαµηλό κόστος και εκτελούνται σε σύντοµο χρονικό διάστηµα. Οι µέθοδοι βασίζονται (α) σε βιοαισθητήρα DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων, ο οποίος καθιστά εφικτή την άµεση οπτική ανίχνευση του προϊόντος της γονοτυπικής αντίδρασης χωρίς τη χρήση οργάνων ή (β) στη βιοφωταυγειοµετρική ανίχνευση του προϊόντος της γονοτυπικής αντίδρασης σε φρεάτια µικροτιτλοδότησης. Στις µεθόδους ανίχνευσης µε το βιοαισθητήρα αξιοποιούνται οι οπτικές ιδιότητες νανοσωµατιδίων χρυσού ενώ στη βιοφωταυγειοµετρική µέθοδο χρησιµοποιείται ως ιχνηθέτης η φωτοπρωτεΐνη αικουορίνη. Οι μέθοδοι αυτές εφαρμόζονται στη ταυτοποίηση ποικιλιών καφέ. Οι ποικιλίες καφέ επιλέχθηκαν ως μοντέλο εφαρμογής των μεθόδων στοχεύοντας στη διείσδυση των μοριακών τεχνικών στην ταυτοποίηση τροφίμων.

Στην παρούσα διατριβή μελετώνται επίσης οι φωτοχημικές ιδιότητες μιας χρωστικής, της SYBR Green I, η οποία φθορίζει όταν συμπλέκεται με διάφορους τύπους DNA. H μελέτη αυτή γίνεται τόσο με κλασσική φθορισμομετρία όσο και με φασματοσκοπία φθορισμού χρονικής ανάλυσης η οποία επιτρέπει την εξέταση υπερταχέων φαινομένων που συμβαίνουν στη φύση και εντάσσονται στη χρονική κλίμακα των fs και ps. Το Θεωρητικό µέρος της διατριβής αποτελείται από έξι κεφάλαια. Στο Κεφάλαιο 1 γίνεται αναφορά στη δομή του DNA και στη συνέχεια περιγράφεται η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), μια τεχνική που επιτρέπει τον εκθετικό πολλαπλασιασμό του DNA. Στο Κεφάλαιο 2 περιγράφονται διάφορες τεχνικές ανάλυσης των προϊόντων της PCR. Στη συνέχεια (Κεφάλαιο 3) παρουσιάζονται μέθοδοι ανίχνευσης μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Δίνεται έμφαση στη γονοτύπηση, τη διάκριση δηλαδή μεταξύ των διαφόρων αλληλίων και τις αντιδράσεις με τις οποίες αυτή επιτυγχάνεται. Στο Κεφάλαιο 4 περιγράφεται ο ρόλος των νανοσωματιδίων χρυσού στις αναλύσεις DNA. Γίνεται αναφορά στον τρόπο σύνθεσης των νανοσωματιδίων, στις οπτικές ιδιότητές τους και στους διάφορους τρόπους λειτουργικής τους τροποποίησης. Στο επόμενο κεφάλαιο (Κεφάλαιο 5) παρουσιάζονται τα φαινόμενα της χημειοφωταύγειας και της βιοφωταύγειας και αναφέρονται οι συνηθέστεροι ιχνηθέτες σε αναλύσεις DNA. Στο Κεφάλαιο 6 γίνεται αναφορά στη δυναμική των διεγερμένων καταστάσεων σε μετρήσεις φθορισμού. Αρχικά γίνεται παρουσίαση της φασματοσκοπίας χρονικής ανάλυσης και ακολουθεί η περιγραφή του laser παλμών femtoseconds καθώς επίσης και περιγραφή της πειραματικής διάταξης της φασματοσκοπίας χρονικής ανάλυσης που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματά μας. Το Πειραματικό µέρος της διατριβής αποτελείται από τέσσερα κεφάλαια. Στο Κεφάλαιο 7 παρατίθενται τα όργανα και τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της πειραµατικής εργασίας. Στο Κεφάλαιο 8 περιγράφεται η ανάπτυξη µεθόδου η οποία συνδυάζει αντίδραση επέκτασης εκκινητή µε τον προαναφερθέντα βιοαισθητήρα DNA για τη γονοτύπηση ποικιλιών καφέ. Σε αντίθεση με τις άλλες υπάρχουσες μεθόδους γονοτύπησης η προτεινόμενη μέθοδος επιτρέπει την οπτική ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή, μέσα σε μερικά λεπτά, χωρίς τη χρήση ειδικής οργανολογίας. Στη συνέχεια (Κεφάλαιο 9), περιγράφεται μια ταχεία, χαμηλού κόστους, μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ποικιλιών καφέ η οποία συνδυάζει μια αντίδραση επέκτασης εκκινητή με μια βιοφωταυγειομετρική δοκιμασία υβριδοποίησης. Ως ιχνηθέτης χρησιμοποιείται η φωτοπρωτεΐνη αικουορίνη. Στο Κεφάλαιο 10 πραγματοποιείται μελέτη των φωτοφυσικών ιδιοτήτων της χρωστικής SYBR green I σε ελεύθερη μορφή αλλά και συνδεδεμένη με μονόκλωνο (ssDNA), δίκλωνο (dsDNA) και τρίκλωνο DNA (tsDNA). Παρουσιάζονται μετρήσεις σταθερής κατάστασης αλλά και μετρήσεις χρονικής ανάλυσης. Η αποδιέγερση φθορισμού μελετάται στην περιοχή των femtoseconds παρέχοντας τη χρονική ανάλυση που απαιτείται για τη μελέτη υπερταχέων φαινομένων στη SYBR green I.